深色有隔内生真菌与褐环乳牛肝菌双接种对樟子松生长及抗立枯病的影响

邓勋，宋小双，尹大川，宋瑞清

(1 黑龙江省森林保护研究所，黑龙江 哈尔滨 150040； 2 沈阳农业大学林学院，辽宁 沈阳 110000； 3 东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

深色有隔内生真菌与褐环乳牛肝菌双接种对樟子松生长及抗立枯病的影响

邓勋1，宋小双1，尹大川2，宋瑞清3

(1 黑龙江省森林保护研究所，黑龙江 哈尔滨 150040； 2 沈阳农业大学林学院，辽宁 沈阳 110000； 3 东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

通过测定樟子松苗木生物量、抗逆生理指标及立枯病发生率，探讨单接种与双接种深色有隔内生真菌PhialocephalafortiniiD575和褐环乳牛肝菌SuillusluteusN94后对樟子松生长及抗病性的影响。结果表明：双接种处理对樟子松苗木促生效果最好，苗高、地径、鲜重和干重比对照分别提高11.18%，14.11%，24.13%，41.09%。接种内生真菌和外生菌根菌可提高樟子松苗木对立枯丝核菌的抗性，在接种立枯丝核菌后，双接种处理的樟子松苗木保护酶CAT、POD和SOD酶活性比对照分别提高32.65%，10.96%和19.39%，丙二醛含量降低23.42%，β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性分别提高33.97%和36.92%，内生真菌和外生菌根菌的存在可以降低苗木立枯病的发生率，提高苗木成活率。

樟子松；深色有隔内生真菌；外生菌根菌；促生抗病

外生菌根菌在提高根系对营养元素和水分的吸收，产生生长激素促进植物生长，改善植物根际环境等多方面发挥着不可替代的作用[1]，同时外生菌根菌通过产生抗生素、提高宿主植物抗逆性等来防治或减轻某些植物病害，特别是土传病害，如用外生菌根菌纯培养物对落叶松Larixspp.、樟子松Pinussylvestrisvar.mongolica幼苗进行人工接种，降低了松苗猝倒病的发病率[2]。接种外生菌根菌增加了植物的抗性，对非根部病害如枯梢病、烂皮病等也有一定的防治作用[3]。深色有隔内生真菌是植物内生真菌的主要类群，在针叶树中，主要的深色有隔内生真菌种类是子囊菌(Ascomycetes)中的Phialocephalafortiniis.l.—Acephalaapplanataspecies complex (PAC)类群集合[4]，可以在宿主根系定殖，并有效抑制土传病害的发生，如P.subalpina的存在可以降低腐霉菌对云杉苗木的危害，同时增加云杉苗木的生物量[5]。部分PAC菌株具有代谢出抑制病原菌生长的产物，P.europaea的代谢产物中分离得到的sclerin，sclerolide，sclerotinin A以及sclerotinin B，可以显著抑制病原菌生长[6]。

樟子松是我国北方主要造林树种，在生态建设、环境修复方面发挥重要作用[7]，外生菌根菌与深色有隔内生真菌在针叶植物根际的双接种对植物的促生抗逆是否能发挥协同增效作用，目前还未见报道，褐环乳牛肝菌SuillusleutusN94和深色有隔内生真菌PhialocephalafortiniifortiniiD575是课题组前期分离筛选的高效菌株[8-9]，本研究通过不同试验设计，研究双接种和单一接种条件下，深色有隔内生真菌与褐环乳牛肝菌对樟子松生长及抗立枯病的影响。

1 材料与方法

樟子松种子购自章古台樟子松苗木繁育基地，保存于-20℃冰箱备用。种子处理及播种参考尹大川[10]方法，将经催芽的樟子松种子播入营养钵中，每钵30粒，上覆无菌土，浇透水后放入大棚中培养，待幼苗出土后，定苗至每钵20株，常规管护。

1.2 接种试验设计

菌剂制备：用5 mm的无菌打孔器分别切取培养好的深色有隔内生真菌D575和外生菌根菌褐环乳牛肝菌N94，接种到250 mL PD液体培养基中，置于摇床上(25℃，150 r/min)振荡培养，D575培养7 d，N94培养20 d，得到液体菌剂，使用前将菌丝体搅碎做匀浆处理。

接种试验设计： 在播种樟子松苗1个月后，进行深色有隔内生真菌和褐环乳牛肝菌的接种处理，共4种处理方式：1.双接种深色有隔内生真菌D575和褐环乳牛肝菌N94(简称D575+N94)；2.单接种深色有隔内生真菌D575(简称D575)；3.单接种褐环乳牛肝菌N94(简称N94)；4.PD培养基空白对照(CK)。在苗木根际打孔，接种液体菌剂，每钵接种100 mL，每组处理20钵，共80钵。

1.3 立枯丝核菌的接种 内生真菌和外生菌根菌接种处理1个月后，接种立枯丝核菌。立枯丝核菌菌土及接种参考唐明[11]的方法进行，用无菌打孔器切取培养好的立枯丝核菌菌饼，接种到250 mL PD液体培养基中，置于摇床上(25℃，150 r/min)振荡培养7 d。接种前按照菌液与栽培基质1∶100体积比混合，搅拌均匀后用于接种，每钵接种菌土100 mL，覆盖到土表。

1.4 取样及相关指标测定

1) 樟子松苗病情调查。立枯丝核菌接种15 d后调查苗木发病情况，计算发病率及相对防治效果。

第二,至40年代，英美陌生化文学特点初步形成。在这一阶段,英美作家受到一战的影响,战前的繁华变为废墟，面对无边的废墟，作家们再也无法将对美好生活的憧憬和向往寄托于田园生活,只能通过更为虚幻的语言形式来表现内心的空虚和迷乱。因此，这个阶段的陌生化文学作品重点描述人物的主观感受，而不是外部的客观现实。

2)抗病相关生理指标测定。参考唐明[11]的方法，在立枯丝核菌接种前和接种15 d后分别取样，采用南京建成生物工程公司的试剂盒测定[12]抗氧化酶，如超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和 抗病保护酶(几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶)活性，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法测定[13]，每处理3次重复。

3)生长指标测定。在内生真菌和外生菌根菌接种3个月后，每处理随机挖取30株樟子松苗木，测定苗木生长指标，用直尺和游标卡尺分别测量苗高和地径。取样苗木，用刷子小心清理掉根际泥土，用电子天平测定苗木鲜重后，在鼓风干燥箱中85℃烘干后称量苗木的干重。

1.5 数据处理 所得数据用SPSS 13.0进行单因素差异显著性分析(ANOVA)，α=0.05，并以平均值±标准差的形式表示。

2 结果与分析

2.1 不同接种处理对樟子松苗木生长的影响

1)对樟子松苗高的影响。各接种处理组均提高了苗木的高生长，与对照差异显著(Plt;0.05)(表1)。接种3个月后，与CK相比，单接种N94与D575苗高分别提高12.65%和8.12%，双接种N94+D575苗高提高11.18%。方差分析结果表明单接种N94 、D575与双接种N94+D575处理之间对苗高影响差异不显著(Pgt;0.05)。

2)对地径的影响。各处理组均显著提高苗木的地径(表1)。接种3个月后，与CK相比，单接种N94与D575分别提高地径生长12.94%和5.88%，双接种N94+D575提高14.11%。与单接种N94和D575相比，双接种处理地径分别提高1.04%和7.78%，N94 +D575和N94单接种处理与CK和D575单接种处理相比，差异显著(Plt;0.05)。

3)对苗木生物量的影响。各处理组苗木生物量显著提高，与对照差异显著(Plt;0.05)(表1)。

在苗木鲜重方面：接种3个月后，与CK相比，单接种N94与D575分别提高20.68%和13.79%，双接种苗高提高24.13%；而这3个接种处理之间对苗高影响差异不显著(Pgt;0.05)。

在苗木干重方面：单接种N94与D575苗木的干重分别比CK高35.67%和21.61%，双接种比CK高41.09%。

上述结果证明，双接种对提高樟子松苗木生长具有促进作用，苗高、地径、苗木鲜重和干重比对照显著增加，菌株D575和N94具有良好的兼容性，有效促进苗木的生长，增加其生物量。单接种方面，外生菌根菌N94在提高苗木生长方面作用明显。D575在提高苗木抗病性方面的作用，需要在立枯丝核菌接种后，用苗木抗病性生理指标的变化来验证。

表1 不同接种处理对樟子松苗木生长指标的影响

注：进行单因素方差分析，同列标有不同字母者表示组间差异显著性水平不同(Plt;0.05)。

2.2 不同接种处理对樟子松苗木抗猝倒病的影响

1)对苗木抗氧化酶活性的影响。接种病原菌前后樟子松苗木的抗氧化酶活性均有提高，根际益生菌的存在可提高苗木的保护酶活性。接种后的保护酶SOD、POD、CAT活性由大到小排序为D575+N94，D575，N94，CK。除POD外，益生菌D575和N94存在条件下，立枯丝核菌接种处理后，樟子松苗木的SOD和CAT活性与对照相比均有显著性差异(Plt;0.05)。不同接种处理之间除SOD外，POD和CAT活性差异不显著(Pgt;0.05)。不同接种处理之间比较，双接种效果最好，与对照相比，CAT、POD和SOD酶活分别提高32.65%，10.96%和19.39%，证明双接种处理有效增加植物体内的保护酶活性，以抵抗生物胁迫等逆境条件(表2)。

表2 D575、N94不同接种处理在病原菌接种前后对樟子松抗氧化酶的影响

注：进行单因素方差分析，同列标有不同字母者表示组间差异显著性水平不同(Plt;0.05)。

2)对苗木丙二醛和抗病保护酶活性的影响。活性氧代谢是植物对逆境胁迫的初始反应，生物胁迫条件下，植物体内活性氧的积累加剧，导致膜质过氧化产物丙二醛含量迅速增加，而外生菌根菌和内生真菌可提高宿主植物保护酶系活性，从而清除生物胁迫所产生的超氧自由基和活性氧，减轻逆境对宿主植物的伤害。未接种外生菌根菌N94和内生真菌D575条件下，立枯丝核菌处理后，樟子松苗木丙二醛含量显著增加(表3)，CK与其他接种处理比较存在显著性差异(Plt;0.05)。与对照相比，D575+N94、D575和N94这3种接种处理丙二醛含量分别降低23.42%，22.15%和10.75%，其中双接种降低效果最显著，证明植物根际益生菌的存在可提高宿主植物的抗逆抗病性。

各接种处理组均可提高苗木β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性(表3)。与对照相比，单接种N94和D575苗木的β-1,3-葡聚糖酶活性分别提高14.66%和33.72%，双接种N94+D575提高33.97%；与对照相比，单接种菌株N94和D575苗木的几丁质酶活性分别提高9.23%和30.76%，双接种N94+D575提高36.92%。

无论是丙二醛含量还是β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性在立枯丝核菌接种前后均有显著性变化，植物根际益生菌N94和D575的存在可有效缓解宿主植物在逆境胁迫条件下体内的生理变化，降低有害物质累积，提高抗病保护酶活性。其中内生真菌D575的存在对提高樟子松苗木抗病性方面发挥了重要作用。

表3 D575、N94不同接种处理在病原菌接种前后对樟子松丙二醛含量和抗病保护酶活性的影响

注：进行单因素方差分析，同列标有不同字母者表示组间差异显著性水平不同(Plt;0.05)。

2.3 不同接种处理对樟子松抗立枯病的影响 通过人工接种，在建立“内生菌—外生菌根菌—针叶苗木”体系基础上，进行丝核菌接种处理，结果表明，内生真菌和外生菌根菌的存在可以降低苗木立枯病的发生(表4)，其中双接种D575+N94、单接种D575、N94的防治效果分别为55.25%，53.56%和46.02%，成活率分别为70.25%，70.11%和65.14%。

表4 不同接种处理对樟子松抗立枯病的影响

注：进行单因素方差分析，同列标有不同字母者表示组间差异显著性水平不同(Plt;0.05)。

3 结论与讨论

多数根际有益微生物间的互作包括共生、拮抗、竞争，对植物的作用主要表现为协同增效、相互的功能抑制等，多数研究表明有益微生物的共同使用相对单一使用表现出对植物更强的促生作用和抗病能力。外生菌根菌和深色有隔内生真菌是针叶树根际重要的益生真菌，本研究通过单接种和双接种方式，测定了褐环乳牛肝菌N94与深色有隔内生真菌D575对樟子松苗木生长和抗立枯病的影响。

在促生方面，益生菌的接种对苗木具有较强的促生作用，双接种处理对苗高、地径、鲜重和干重分别比对照提高11.18%，14.11%，24.13%和41.09%。褐环乳牛肝菌N94是项目组筛选得到的高效外生菌根菌，其对樟子松和红皮云杉均具有促生抗逆作用[14-15]，N94与木霉菌的双接种也表现出良好的兼容性。在提高樟子松苗木抗逆性方面，双接种处理可提高樟子松苗木对立枯丝核菌的抗性，在接种立枯丝核菌后，保护酶CAT、POD和SOD酶活性与对照相比分别提高32.65%，10.96%和19.39%，丙二醛含量降低23.42%，β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性分别提高33.97%和36.92%。宿主植物在受到立枯丝核菌等病原菌侵染后，抗逆相关酶活性的迅速升高是宿主植物抗病能力强弱的表现之一，对宿主植物防卫反应的启动和快速应答具有重要意义。接种菌根菌和深色有隔内生真菌后，与对照相比，可显著提高宿主植物的保护酶(SOD、POD和CAT酶)和抗病酶(β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶)活性，从而抑制病害的发生。而保护酶的活性提升，可以降低逆境条件下宿主植物丙二醛的大量累积，减少对植物的伤害。在立枯丝核菌的接种试验中，内生真菌和外生菌根菌的存在可以降低苗木立枯病的发生，其中双接种D575+N94和单接种D575的防治效果好于单接种N94，表明深色有隔内生真菌D575的存在更多的是起到提高植物抗逆性的作用，与生防菌株如木霉菌[16-17]、生防细菌[18-19]等相比，防治效果有一定差距，而内生菌和外生菌的主要作用是在提高植物耐旱[20-21]、耐盐碱[22]、耐污染土壤方面的，因此建议在后续的苗木根部保健剂制备中加入木霉菌、生防细菌等以有效控制病害发生，课题组在下一步工作中也计划加入木霉菌、多粘类芽孢杆菌等，探讨多重益生菌接种对樟子松苗木生长的影响。

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(责任编辑 杨静莉)

EffectofinoculatingPhialocephalafortiniiD575andSuillusluteusN94onthegrowthofPinussylvestrisvar.mongolicaanditsresistanttodamping-off/

DENG Xun,et al.

( Forestry Protection Institute of Heilongjiang Forestry Academy,Harbin 150040,China)

The dark septate endophyte(DSE) fungi and ectomycorrhiza fungi are two main rhizosphere microorganism groups of coniferous species,and play an important role in growth promotion and stress resistance to host.Seedling biomass,physiological index of disease resistance and the incidence of damping off were determinated to research the growth promotion and disease resistant ofPinussylvestrisvar.mongolica inoculated by dark septate endophyte fungi D575 and ectomycorrhiza fungi N94 in this paper.The results indicate that:dual inoculation of D575 and N94 have the best effection on seedling growth promotion,the seedling height,ground diameter,fresh and dry weight enhanced 11.18%,14.11%,24.13% and 41.09% respectively in contrast to control.Inoculated D575 and N94 can enhance the seedling disease resistant.After inoculatingRhizoctoniasolani,the seedling CAT,POD and SOD enzyme activity enhanced 32.65%,10.96% and 19.39%,the MDA content decreased 23.42%,and the β-1,3-glucanase and chitinase activity enhanced 33.97% and 36.92% in contrast to control.In the end,damping-off incidence of inoculate seedlings were lower than that of the uninoculate treatments.

Pinussylvestrisvar.mongolica；dark septate endophyte(DSE) fungi;ectomycorrhiza fungus;growth promotion and disease resistant

2015-12-14

国家自然科学基金项目(31200484，31170597)，国家“十二五”科技攻关项目专题(2012BAD19B0801)，黑龙江省森工总局项目(SGZJY2010014，SGZJY2012016)

邓勋(1978—)，男，研究员，农学博士，主要研究方向：菌物开发利用及林木病害可持续控制，E-mail:dxhappy@126.com

宋瑞清，教授，主要研究方向：菌物开发利用及食用菌遗传育种。

S763.15

A

1671-0886(2017)01-0021-05