四种植物精油对枸杞蚜虫的毒力及3种酶活性的影响

刘丽梅，段立清,，苏柳，冯淑军

( 1.内蒙古农业大学农学院，内蒙古 呼和浩特 010019； 2.内蒙古农业大学林学院，内蒙古 呼和浩特 010019)

四种植物精油对枸杞蚜虫的毒力及3种酶活性的影响

刘丽梅1，段立清1,2，苏柳2，冯淑军1

( 1.内蒙古农业大学农学院，内蒙古 呼和浩特 010019； 2.内蒙古农业大学林学院，内蒙古 呼和浩特 010019)

为给枸杞蚜虫Aphissp.的生物防治及新型杀虫剂的开发提供理论依据，采用玻璃管药膜法和广口瓶密闭熏蒸法，分别测定4种植物精油对枸杞蚜虫的触杀和熏蒸毒力，采用分光光度计法测定4种精油对枸杞蚜虫羧酸酯酶(CarE)、乙酰胆碱酯酶(AChE)和谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)活性的影响。结果表明：罗勒Ocimumbasilicum，藿香Agastacherugosus，砂地柏Sabinavulgaris，薄荷Menthalongifolia精油对枸杞蚜虫的触杀致死中浓度LC50分别为2.52，2.78，2.82，2.86 mL/L；熏蒸处理枸杞蚜虫24 h的熏蒸致死中浓度LC50依次为0.81，1.28，1.36，1.56 mL/L；4种精油对枸杞蚜虫的毒杀作用显著。4种植物精油对枸杞蚜虫CarE、AChE和GSTs酶活性有不同程度的抑制作用，罗勒精油对CarE和GSTs的抑制作用强，藿香和沙地柏精油对AChE的抑制作用强。

枸杞蚜虫；精油；毒力；酶活性

枸杞Lyciumspp.为茄科枸杞属多年生灌木，枸杞的果实、枝叶营养丰富，易受多种病虫害的危害。枸杞蚜虫Aphissp.就是其中主要害虫，刺吸危害枸杞嫩叶、花蕾、幼果和生长点，造成枸杞大量减产。蚜虫具有生活周期短、繁殖力强等特征，因而很难防治。目前，枸杞蚜虫的防治主要以化学药剂为主，如高效氯氟氰菊酯[1]、3%啶虫脒[2]、阿维菌素[3]、10%吡虫啉与3%苯氧威[4]等。但长期使用化学农药使枸杞蚜虫产生了抗药性[5]，污染环境、影响食品安全[6]。

芳香植物精油是植物内重要的次生物质，其天然香气成分有趋避、防治害虫的作用[7]。由于对人畜安全、不污染食物及环境、害虫不易产生抗药性等特点备受关注。应用芳香植物及精油防虫、驱虫在国内外已有一些报道。例如：Sampson等研究了23种精油对萝卜蚜虫Lipaphispseudobrassicae的毒杀活性，均表现为很强的毒杀作用，其中薄荷Menthalongifolia精油的毒杀活性最强[8]。薄荷、百里香Thymusvulgaris2种精油对桃蚜Myzuspersicae的趋避效果均超过70%[9]，罗勒Ocimumbasilicum、丁香罗勒Ocimumgratissimum精油熏蒸处理四纹豆象Callosobruchusmaculatus成虫24 h，分别有80%和70%的成虫死亡[10]。罗勒和百里香精油对二斑叶螨TetranychusurticaeKoch和烟粉虱Bemisiatabaci(Genn)有明显的触杀作用[11]。藿香Agastacherugosus提取物对米象Sitophilusoryzae和绿豆象Callosobruchuschinensis有很强的触杀作用[12]。用藜芦碱[13]和外源茉莉酸诱导[14]等方法防治枸杞蚜虫也有一定效果，而芳香植物及其精油对枸杞蚜虫的影响尚未见报道。

羧酸酯酶(CarE)是昆虫体内的重要解毒酶系[15]；乙酰胆碱酯酶(AChE)是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫药剂的靶标酶，该酶对药剂敏感度的改变会影响到杀虫药剂的毒力[16]；谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)是害虫对杀虫剂产生代谢抗性的重要酶系，参与许多分子的解毒机制[17]。目前关于薄荷、藿香、罗勒、砂地柏Sabinavulgaris精油对枸杞蚜虫酶活性的影响还没有相关报道，作者测定了4种植物精油对枸杞蚜虫的触杀和熏蒸毒力及对枸杞蚜虫离体CarE、AChE和GSTs活性的影响，为进一步了解这4种精油的杀虫活性及杀虫作用机理，开发环境友好、高效、安全的新型杀虫剂提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料 供试昆虫枸杞蚜虫采自内蒙古农业大学科技园的枸杞林，接于实验室内栽培的枸杞苗上培养待用。3种供试精油薄荷、藿香、罗勒购于北京茂思商贸有限公司，砂地柏精油由内蒙古农业大学林学院提取。

供试药剂固蓝B盐、硫代乙酰胆碱(ASCh)、5,5′-二硫双硝基苯甲酸(DTNB)购于Sigma公司；考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白购于Amresco公司；十二烷基硫酸钠(SDS)、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、α-乙酸萘酯(α-NA)购于国药集团化学试剂有限公司；毒扁豆碱购于Fluka公司；GSTs试剂盒购于南京建成生物工程研究所；丙酮、95%乙醇均为国产分析纯。

仪器有TU- 1810紫外可见分光光度计( 北京普析通用仪器有限公司)，D- 78532 高速冷冻离心机 ( 德国Hettich)，Sartorius BSS110S 电子天平( 北京塞多利有限公司)，HH-S 型恒温水浴锅 ( 武汉金宝华公司)，移液枪等。

1.2 试验方法

1.2.1 植物精油对枸杞蚜虫的生物活性测定

1.2.1.1 熏蒸作用 用广口瓶密闭熏蒸法[18]进行熏蒸毒力测定。以丙酮作为溶剂，通过预实验将4种精油配置成0.25，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 mL/L 6个浓度。挑取枸杞无翅蚜虫30头放入125 mL的广口瓶中，用微量移液枪移取不同浓度的精油10 μL滴于1 cm×4 cm的滤纸片上，使之悬于广口瓶内，用封口膜密封；对照为丙酮。每个处理3个重复，熏蒸24 h后记录死亡虫数，以毛笔拨动虫体，无反应者视为死亡。

1.2.1.2 触杀作用 采用玻璃管药膜法[19]测试4种植物精油对枸杞蚜虫的触杀作用。以丙酮为溶剂将4种精油稀释成1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，4.5，5.0 mL/L 6个浓度，分别吸1 mL于1.1 cm×8 cm的指形管内，旋转使液体在管内壁成膜，对照管为丙酮，待丙酮挥发后进行毒力测定。挑取枸杞无翅蚜虫30头置于管内，每个处理设3个重复。4 h观察记录死亡虫数。

1.2.2 植物精油对枸杞蚜虫3种离体酶的抑制作用测定

1.2.2.1 酶液和抑制剂制备 取枸杞蚜虫100头，加入预冷的0.04 mol/L pH7.0的磷酸缓冲液1 mL，于预冷玻璃匀浆器中冰浴匀浆，4 ℃下匀浆液12 000 rmp离心15 min，取上清液为CarE酶液。以相同方法，取200头蚜虫用0.1 mol/L pH7.6的磷酸缓冲液制备AChE酶液；取200头蚜虫用匀浆介质(0.1 mol/L pH7.4的磷酸缓冲液，0.01 mol/L 的Tris-HCl，0.000 1 mol/L的EDTA-2Na，0.01 mol/L蔗糖和0.8%氯化钠溶液)制备GSTs酶液。

取上述4种植物精油以丙酮为溶剂稀释成0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 mL/L 6个浓度作为抑制剂。

1.2.2.2 对CarE抑制作用 参照 Van Aspern[20]的方法，抑制剂与CarE酶液以及α-NA构成反应体系，在 30 ℃水浴反应 15 min 后加入显色剂(1%固蓝 B 盐与 5%十二烷基硫酸钠( SDS) 溶液按2∶5比例混合)终止反应，静置5 min后在紫外可见分光光度计600 nm下测定吸光(OD)值。以丙酮为对照，每组重复3次。按以下公式计算酶活性抑制率。

CarE活性抑制率(%)=(对照OD值-处理OD值)/对照OD值×100

1.2.2.3 对AChE抑制作用 参照Gorun[21]等的方法，抑制剂与AChE酶液以及硫代乙酰胆碱(ASCh)构成反应体系，在 30 ℃水浴反应20 min，加入DTNB终止反应，静置2 min后用紫外可见分光光度计在412 nm下测定OD值，以丙酮为对照。每组重复3次。

1.2.2.4 对GSTs抑制作用 取上述抑制剂，以丙酮为对照。按照GSTs试剂盒(购于南京建成生物工程研究所)说明书进行。每组重复3次。

1.3 数据处理 毒力测定数据采用 POLO软件处理，计算LC50、LC90值和95%置信区间、斜率以及自由度。将抑制剂的终浓度转换成负对数值与对应的抑制率的机率值作图，计算出4种精油对CarE、AChE和GSTs的抑制中浓度(I50)。

2 结果与分析

2.1 4种植物精油对枸杞蚜虫的熏蒸作用 枸杞蚜虫对罗勒精油最敏感，罗勒精油熏蒸处理24 h对枸杞蚜虫的致死中浓度LC50值最小，为0.81 mL/L，其95%的置信区间0.65～0.98 mL/L，与薄荷精油1.25～1.96 mL/L、藿香精油1.04～1.56 mL/L和沙地柏1.12～1.65 mL/L之间均没有覆盖，说明罗勒精油的熏蒸毒力与其他3种精油间存在极显著差异，薄荷精油与藿香精油的置信区间覆盖率小于50%，说明二者存在显著差异，藿香精油与沙地柏精油的置信区间覆盖率大于50%，说明2种精油间不存在差异，即枸杞蚜虫对薄荷精油的敏感性最低，熏蒸处理24 h其LC50值为1.56 mL/L。即4种植物精油对枸杞蚜虫的熏蒸毒力由大到小依次为罗勒、藿香、沙地柏、薄荷。4种精油的回归斜率有一定差异，枸杞蚜虫个体对罗勒精油的敏感性差异较小(表1)。

表1 4种植物精油熏蒸处理24 h对枸杞蚜虫的熏蒸毒力

2.2 4种精油对枸杞蚜虫的触杀作用 罗勒精油对枸杞蚜虫的触杀活性最高，LC50值为2.52 mL/L，其95%置信区间为2.33～2.71 mL/L，与薄荷精油2.52～3.24 mL/L、藿香精油2.59～2.98 mL/L和沙地柏精油2.62～3.31 mL/L之间的覆盖率均小于50%，根据Ebling对LC50值95%置信区间的分析[22]，罗勒精油的触杀作用与其他3种精油之间存在显著差异；薄荷、藿香和沙地柏3种精油的95%置信区间的覆盖率均大于50%，说明3种精油对枸杞蚜虫的触杀毒力间差异不显著，薄荷精油的敏感性最低，LC50值为2.86 mL/L。即4种精油的触杀毒力由大到小依次为罗勒、藿香、沙地柏、薄荷(表2)。

表2 4种植物精油对枸杞蚜虫的触杀毒力

2.3 精油对3种酶的抑制作用 4种植物精油对枸杞蚜虫CarE、AChE、GSTs均有不同程度的抑制作用，且抑制作用呈明显的剂量—效应关系，即随精油浓度的升高，抑制作用加强。

抑制中浓度(I50)通常表示酶对抑制剂的敏感度，I50值越大，说明酶对抑制剂越不敏感；反之，I50值越小，说明越敏感。罗勒精油对CarE的抑制作用最强，其I50值为3.05 mL/L，明显低于其他3种精油，薄荷，藿香，沙地柏精油的I50值分别为罗勒精油的1.35，2.37，3.57倍，4种精油对CarE的抑制效果从强到弱顺序为罗勒，薄荷，藿香，沙地柏精油。藿香和沙地柏精油对AChE的抑制作用强，I50值分别为5.64 mL/L和5.74 mL/L，薄荷和罗勒精油对AChE的抑制作用较弱，其I50值分别为藿香精油的1.65和3.14倍。罗勒精油对枸杞蚜虫GSTs抑制作用最强，I50值为1.71 mL/L，其次为藿香、薄荷及沙地柏精油(表3)。

表3 4种精油对枸杞蚜虫3种酶抑制中浓度的比较

注：*以最小抑制中浓度I50值为1进行比较。

3 结论和讨论

4种植物精油对枸杞蚜虫均有很强的熏蒸活性和一定的触杀作用，熏蒸活性高于触杀活性。4种精油对枸杞蚜虫3种离体酶均有显著的抑制作用，其中罗勒精油对CarE和GSTs的抑制作用最显著，藿香精油和沙地柏精油对AChE的抑制作用较强，精油对不同酶类活性的抑制作用与其杀虫机理的关系有待进一步研究。

Buentello 等发现罗勒精油熏蒸果蝇Anastrephaludens的LC50为8.05 mL/L[23]；熏蒸米象3，4，5 d的LC50分别为8.14，6.50，4.9 μL/mL[24]，我们测定的罗勒精油对枸杞蚜虫的熏蒸和触杀致死中浓度LC50值分别为0.81，2.52 mL/L，罗勒精油对枸杞蚜的毒杀作用较强。藿香精油对白纹伊蚊Aedesalbopictus的熏杀效果最好，LC50值为26.12 μg/cm3[25]，藿香精油对枸杞蚜虫的熏蒸LC50值为1.28 mL/L，明显低于对白纹伊蚊的LC50值。薄荷精油熏蒸朱砂叶螨Tetrangchuscinubrinus24 h的LC50值为0.347 9 mg/L[26]，相同时间对枸杞蚜虫的熏蒸LC50值为1.56 mL/L，对枸杞蚜虫的熏杀作用不及对朱砂叶螨的；砂地柏精油熏蒸玉米象SitophiluszeamaisMotschulsky、赤拟谷盗Triboliumcastaneum(Herbst)、粘虫MythimnaseparataWalker和小菜蛾Plutellaxylostella(Linnaeus)的LC50值分别为161.12，100.12，22.13，9.74 mg/L[27]，均高于对枸杞蚜虫的LC50值1.36 mL/L，薄荷和沙地柏精油对枸杞蚜虫也有较高的毒杀作用。

CarE在昆虫代谢药物的过程中起着重要的解毒作用[28]，多种有机磷农药对棉铃虫Helicoverpaarmigera( Hübner) CarE有明显的抑制作用[29]，植物性辣椒碱对烟粉虱BemisiatabaciGennadius体内CarE有明显的抑制作用[30]，猪毛蒿精油对玉米象酸性磷酸酯酶、碱性磷酸酯酶、羧酸酯酶有明显的抑制作用[31]，我们测定的4种精油对枸杞蚜虫CarE的作用与这些研究结果一致。AChE是有机磷杀虫剂和氨基甲酸酯类杀虫剂的直接作用靶标，AChE对杀虫剂的敏感性下降是害虫抗药性的重要机制之一[17]，测定的4种精油对AChE抑制作用显著，但AChE是否是精油的作用靶标还需深入研究。辣椒碱对小菜蛾[32]、猪毛蒿精油对玉米象的GSTs有明显的抑制作用[31]，测定的4种精油对枸杞蚜虫GSTs作用与前人相似。

植物精油的杀虫成分主要是单萜类化合物[33]，作用位点是昆虫神经系统，是神经系统中章鱼胺受体的拮抗剂[34]，精油导致枸杞蚜CarE、AChE、GSTs等解毒酶活性的降低，是否会影响蚜虫对精油的解毒代谢，从而引起中毒死亡有待深入研究。

[1] 王金富,马孝林,邓景丽,等.7种化学药剂对枸杞蚜虫的室内毒力[J].西北农业学报,2010,19 (5):105-107.

[2] 于晶,周峰,徐荣,等.啶虫脒对枸杞蚜虫防治效果及对枸杞多糖含量的影响[J]. 贵阳中医学院学报,2010,32(3):18-20.

[3] 刘军和.阿维菌素和天敌瓢虫对枸杞蚜虫的控制效果评价[J].北方园艺,2008(11):162-165.

[4] 宗旭祥,彭爱加,王有科,等.几种无公害农药对枸杞蚜虫防治试验[J].甘肃林业科技,2013,38(1):35-37.

[5] 张丛,张海珠,常静,等.四种拟除虫菊酯类杀虫剂对枸杞蚜虫的毒力及对三磷酸腺苷酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性的影响[J].农药学学报,2015,17( 2):235-240.

[6] GEIGER F,BENGTSSON J,BERENDSE F,et al.Persistent negative effects of pesticides on biodiversity and biological control potential on European farmland [J]. Basic and Applied Ecology,2010,11(2):97-105.

[7] PROESTOS C,BOZIARIS I S,NYCHAS G J E.Analysis of flavonoids and phenolic acids in Greek aromatic plants:Investigation of their antioxidant capacity and antimicrobial activity [J]. Food Chemistry,2006,95(4):664-671.

[8] SAMPSON B J,TABANCA N,KIRIMER N,et al.Insecticidal activity of 23 essential oils and their major compounds against adultLipaphispseudobrassicae(Davis) (Aphididae:Homoptera) [J].Pest Management Science,2005,61(11):1122-1128.

[9] HORI M.Repellency of rosemary oil againstMyzuspersicaein a laboratory and in a screenhouse [J]. Journal of Chemical Ecology,1998,24(9):1425-1432.

[10]KÉÏTA S M,VINCENT C,SCHMIT J P,et al.Effect of various essential oils onCallosobruchusmaculatus(F.) (Coleoptera:Bruchidae) [J]. Journal of Stored Products Research,2000,36(4):355-364.

[12]KIM S I,ROH J Y,KIM D H,et al.Insecticidal activities of aromatic plant extracts and essential oils againstSitophilusoryzaeandCallosobruchuschinensis[J]. Journal of Stored Products Research,2003,39(3):293-303.

[13]王芳,李文玲,刘畅,等.藜芦碱对枸杞蚜虫室内活性测定及安全性评价[J]. 北方园艺,2015(2):101-103.

[14]宫玉艳,段立清,王爱清,等.外源茉莉酸诱导枸杞对枸杞蚜生长发育和繁殖的影响[J].昆虫学报,2010,53( 6):670 -674.

[15]宗静，张帆，孙光芝,等.繁殖寄主对赤眼蜂羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的影响[J].昆虫学报，2000,43(增刊):70-76.

[16]李飞，韩召军，唐波.抗性品系棉蚜乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶的变异[J].昆虫学报，2003,46 ( 5):578-583.

[17]任学祥,王刚,左一鸣,等.噻虫胺对桃蚜的毒力及其亚致死剂量对桃蚜解毒酶系活力的影响[J].昆虫学报，2011,54(3):299-305.

[18]田雨浓,马伟,韦庆慧,等.α-萜品醇熏蒸对大麦虫体内抗氧化酶活性的影响[J].昆虫学报,2013,56(1):47-53.

[19]鲁艳辉,杨婷,高希武.禾谷缢管蚜和麦长管蚜玻璃管药膜法敏感毒力基线的建立[J]. 昆虫学报,2009,52(1):52-58.

[20]ASPEM K J V.A study of housefly esterase by means of a sensitive colorimetric method[J].Journal of Insect Physiology,1962,8(4):401-416.

[21]GORUN V,PROINOV I,BLTESCU V,et al.Modified Ellman procedure for assay of cholinesterases in crude enzymatic preparations [J].Analytical Biochemistry,1978,86(1):324-326..

[22]EBLING P M,OTVOS I S,CONDER N.Comparative activity of three isolates of LdMNPV against two strains ofLymantriadispar[J].Canadian Entomologist,2004,136(5):737-747.

[23]BUENTELLO-WONG S,GALN-WONG L,ARÉVAO-NIO K,et al.Toxicity of some essential oil formulations against the Mexican fruit flyAnastrephaludens(Loew) (Diptera:Tephritidae) [J]. Industrial Crops and Products,2016,85:58-62.

[24]HOSSAIN F,LACROIX M,SALMIERI S,et al.Basil oil fumigation increases radiation sensitivity in adultSitophilusoryzae(Coleoptera:Curculionidae) [J]. Journal of Stored Products Research,2014,59:108-112.

[25]张云,彭映辉,何建国,等.四种植物精油对蚊虫的熏杀活性及酯酶活性的影响[J].中国生物防治学报,2013,29(4):497-502.

[26]方才君,胡仕林.植物精油对朱砂叶螨的毒性试验[J].西南师范大学学报(自然科学版),1997,22(4):470-472.

[27]高聪芬,张兴.砂地柏精油的熏蒸杀虫活性初探[J].南京农业大学学报 1997,20(3):50～ 53.

[28]郭晶,高菊芳,唐振华.羧酸酯酶及其在含酯类化合物代谢中的作用[J]. 农药,2007,46( 6):365-368.

[29]王旭,高希武,郑炳宗,等.有机磷药剂对棉铃虫羧酸酯酶的抑制作用[J]. 昆虫学报,1998,41(增刊):12-18.

[30]吴咚咚,赵建伟,陈颖,等.辣椒碱对烟粉虱体内羧酸酯酶、谷胱甘肽S-转移酶和乙酰胆碱酯酶活性的影响[J].生物安全学报,2012,21( 2):109-113.

[31]尚利娜,袁海滨,魏春艳,等.猪毛蒿精油对玉米象体内4种解毒酶活力的抑制[J].东北师大学报(自然科学版),2010,42(4):116-120.

[32]纪明山,刘少武,谷祖敏,等.辣椒碱对小菜蛾的驱避活性及其体内谷胱甘肽-S-转移酶和 Na+,K+-ATP 酶活性的影响[J].昆虫学报,2008,51(10):1039 -1043.

[33]AHN Y J,LEE S B,LEE S H,et al.Insecticidal and acaricidal activity of carvacrol and β-thujaplicine derived fromThujopsisdolabratavar.hondaisawdust [J]. Journal of Chemical Ecology,1997,24:81-90.

[34]GROSS A D,KIMBER M J,COATS J R.G-Protein-Coupled receptors (GPCRs) as biopesticide targets:A focus on octopamine and tyramine receptors [J]. ACS Symposium Series,2014,1172:45-56.

(责任编辑 李海燕)

ToxicitiesoffouressentialoilsagainstAphissp.andtheireffectsontheactivitiesofthreeenzymesfromAphissp./

LIU Limei,et al.

(College of Agriculture,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010019,China)

In order to provide a scientific basis for the biological control and the development of the environment-friendly,efficient and safe pesticide againstAphissp.,toxicity activities of four essential oils againstAphissp.were tested with residual film in glass tube and fumigation method,and enzyme activities were tested by the method of spectrophotometer.The results indicated that essential oil fromOcimumbasilicum,Agastacherugosu,SabinavulgarisandMenthalongifoliahad strong contact toxicity againstAphissp.with LC50value of 2.52,2.78,2.82,2.86 mL/L,respectively.Essential oil fromO.basilicumwas the best fumigation againstAphissp.with the lowest LC50value of 0.81 mL/L after fumigated 24 h.The LC50value of essential oil fromA.rugosus,S.vulgarisandM.longifoliawere 1.28,1.36,1.56 mL/L,respectively.Activities of CarE,AChE and GSTs fromAphissp.were obviously inhibited by four essential oils.Essential oil ofO.basilicumhad the strongest inhibition effect on CarE and GSTs,and essential oils fromA.rugosusandS.vulgarishad stronger inhibition effect on AChE than the others.

Aphissp.;essential oil;toxicity;enzymes activity

2016-03-07；

2016-06-12

国家自然科学基金项目(31360182)

刘丽梅(1988—)，女，内蒙古通辽人，硕士研究生，研究方向为农业昆虫与害虫防治，E-mail:liulm2015@126.com

段立清， 教授，E-mail:duanlq2013@163.com。

S763.36

A

1671-0886(2017)01-0005-05