PCR技术鉴别多趾北京油鸡肉

陈静茹，夏海剑，张泽宾，曲鲁江，刘 毅，李兴民,*

PCR技术鉴别多趾北京油鸡肉

陈静茹1，夏海剑2，张泽宾2，曲鲁江2，刘 毅1，李兴民1,*

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.中国农业大学动物科技学院，北京 100094）

北京油鸡是我国珍贵的地方品种，在自然群体中，部分个体表现出多趾性状，该性状是由于其LMBR1基因的246bp处发生突变，突变位点的碱基由C突变为A时表现出多趾形状。本实验根据多趾北京油鸡肉基因型与华都艾拔益加肉鸡基因型的不同，通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）测序法和限制性酶切片段多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技术，确定突变位点的碱基为A或C，从而准确鉴定食品中多趾北京油鸡肉与华都艾拔益加肉鸡的区别。

北京油鸡；艾拔益加肉鸡；多趾；PCR测序；限制性酶切片段多态性（RFLP）

随着我国食品工业的快速发展，市场上不断出现各种各样的肉类食品掺假方式。目前，国内市场在肉及肉制品的生产销售中，一些不良商家通过掺杂掺假、以次充好等手段欺骗消费者，以谋取暴利的事件经常发生。这不仅仅涉及到经济、营养价值和食品安全等问题，甚至会涉及宗教信仰问题，如在清真食品中掺杂猪肉等[1-2]。因此，对食品原料肉进行掺假、掺杂的检验十分必要，鉴定肉制品的品种来源重点就是找到快速、准确的方法。

北京油鸡又称“中华宫廷黄鸡”，以其外形独特，肉味鲜美而著称，是我国珍贵的优良地方品种[3]。在自然群体中，北京油鸡和丝羽乌骨鸡部分个体均存在多趾性状，具有多趾遗传特征[4]。其中丝羽乌骨鸡屠宰后可以通过骨头颜色进行鉴别，而北京油鸡却无法进行有效的鉴别。为解决屠宰后的北京油鸡肉与其他鸡肉无法区别的问题，目前将多趾形状在北京油鸡群体中固定下来的育种工作正在进行，从而为商品鸡提供屠体标识。但目前对切割加工后的多趾北京油鸡肉还是无法进行快速有效鉴别。

原料肉检测的传统方法包括感官检验和免疫学方法[5-6]，这2 种方法可以鉴别生鲜肉的种属，但对于热加工处理的肉类，因为其感官性状、蛋白质成分和其他的免疫原性物质被损坏而难以鉴别。因此，在肉类种属精确鉴定的研究领域，找到方便、快速、准确的方法对食品中动物源成分进行鉴别成为研究者关注的热点[7-15]。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）测序法原理是DNA的半保留复制以及通过温度变化来控制DNA的变性和复性，其具体过程：首先DNA变性从双链变为单链，再通过与引物结合互补变成部分双链，之后在DNA聚合酶的作用下延伸从而得到完整的DNA双链，使得DNA完成复制。通过PCR方法，可以扩增得到大量的DNA片段，结合凝胶电泳、测序等方法即可完成DNA鉴定，从而确定物种的类别[16]。随着PCR检测技术的不断完善和发展，该技术已经渐渐成为国内外最成熟、最广泛使用的肉类掺假检测技术[17-22]。北京油鸡的LMBR1基因，246bp处为突变位点，碱基为A或C，突变位点的碱基为A时表现出多趾性状[23]，如图1所示。

图1 多趾北京油鸡Fig. 1 Multi-toed foot of Beijing-you chicken

本实验取多趾北京油鸡（实验组）和市售华都艾拔益加肉鸡（对照组）的鸡胸肉为样品，提取生肉、热处理（煮制、烤制、炸制）熟肉的基因组DNA为模板，鉴定了食品中多趾北京油鸡肉与艾拔益加肉鸡的区别，为北京油鸡产业的发展提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

多趾北京油鸡由中国农业科学院饲料所南口试验基地提供，华都艾拔益加肉鸡购自美廉美超市。

琼脂糖 西班牙Biowest公司；Mix 北京汇天东方科技有限公司；ddH2O由中国农业大学家禽实验室提供；引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成；TAE缓冲液、1 g/100 mL琼脂糖凝胶、上样缓冲液loading buffer、Marker、EB替代物 北京赛百盛基因技术有限公司；血液组织细胞基因组提取试剂盒和深加工食品DNA提取试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 仪器与设备

PTC-1000PCR扩增仪、稳压稳流电泳仪 美国Bio-Rad公司；5424R型离心机 德国Eppendorf公司；DGG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司；IMS-20型全自动雪花制冰机 常熟市雪科电器有限公司；ImageQuant300凝胶成像系统 美国GE公司；微波炉 韩国LG集团。

1.3 方法

1.3.1 实验样品的采集与处理

以多趾北京油鸡为实验组和华都艾拔益加肉鸡为对照组，将生肉进行热处理（不同温度煮制、烤制、炸制）为熟肉进行下一步的实验。每个样品进行2次重复实验。

热处理方法为分别取鸡胸肉100 g于75、85、95 ℃热水中加热30 min，为煮制样品；取鸡胸肉50 g进行微波烤制，先微波低火（700 W）烤制12 min，再高火（900 W）烤制8 min，得到烤制样品；将鸡胸肉切成大约1 cm×1cm×1 cm的小块，待油锅内温度为170 ℃左右时，将鸡块裹上淀粉糊放入锅内油炸，炸制2 min至表面金黄，得到炸制样品。

1.3.2 模板DNA的制备

选用血液组织细胞基因组提取试剂盒（DP 304）和深加工食品DNA提取试剂盒（DP 326）分别提取生肉样品的DNA和熟肉样品的DNA，实验操作均按照相应说明书进行，DNA提取后置于4℃冰箱保存。

1.3.3 目的条带的PCR扩增

根据样品的数量，确定所需要扩增体系的个数。一般考虑到溶液损失，会适当增加扩增体系的个数。1个体系的试剂用量如表1所示，配比后混合均匀。

表1 PCR扩增体系Table 1 PCR amplification system

取消毒灭菌后的96 孔板，每个孔中加24 μL DNA扩增体系和1 μL DNA，3 000 r/min离心1 min，使整个体系沉降，减少气泡，便于扩增。将96 孔板放入PCR仪中，循环程序为：95 ℃变性20 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 个循环。扩增结束后，取出96 孔板，置于4 ℃冰箱保存。扩增片段长度为389 bp。

1.3.4 扩增产物的凝胶电泳检测

参照夏海剑[24]的方法进行凝胶电泳。其中琼脂糖质量浓度为1.2 g/100 mL，电泳条件为120 V、30 min。

1.3.5 测序

由北京六合华大基因科技股份有限公司合成实验组和对照组的DNA扩增产物，进行测序。

1.3.6 酶切

使用限制性内切酶BsrDⅠ，酶切1.3.5节PCR扩增产物。酶切反应体系见表2，按照表中的数据，配制酶切体系，考虑到会有损失，配制的体系个数应多于实际酶切数量。应注意在配制过程中将BsrDⅠ、10×酶切缓冲液和ddH2O置于冰盒上。

表2 酶切体系Table 2 Enzymatic digestion system

将灭菌后的96 孔板置于冰上，每个孔加入18 μL配制好的酶切液。然后依次加入不同的PCR扩增产物2 μL，3 000 r/min离心1 min。立即放入PCR仪中，65 ℃恒温4 h。酶切结束后，在每个含酶切产物的孔中加入3 μL沉降缓冲液，并使用移液枪抽吸几次，使其混合均匀，以使点样后的酶切产物能沉降。

2 结果与分析

2.1 PCR测序法对多趾北京油鸡生肉和熟肉样品的鉴定

北京油鸡的LMBR1基因，246 bp处为突变位点，碱基为A或C，突变位点的碱基为A时表现出多趾形状。其中野生型纯合体的基因型为CC，性状为4趾；突变型杂合体的基因型为AC，性状为多趾；突变型纯合体的基因型为AA，性状为多趾。根据GenBank（ID：NC-006089）设计引物，使得扩增得到的目的片段包括GenBank（ID：NC-006089）的第5个内含子的第4 645位脱氧核苷酸，引物序列如下：U（上游引物）：5’-GCGATTTCCTCTCACCCACA-3’；D（下游引物）：5’-AGCTGAGCAACATGACAGCA-3’。

将不同处理条件下对照组（市售华都艾拔益加肉鸡）和实验组（多趾北京油鸡）进行PCR扩增后，凝胶电泳检测扩增产物，如图2所示。然后将扩增产物进行测序，使用DNAstar软件将测序结果进行对比，如图3所示。由图2可知，提取样品的基因组DNA进行PCR扩增之后的条带大小为400 bp左右，与曲鲁江等[23]的研究结果一致。样品在经过不同温度的煮制、烤制以及炸制后，PCR扩增结果一致，琼脂糖凝胶电泳检测之后条带大小均为389 bp，说明不同的热处理（煮制、烤制、炸制）对实验组和对照组样品DNA的提取效果影响不大，不同温度的煮制条件（75～95 ℃）对PCR的测序结果基本没有影响。另外，多趾北京油鸡样品在突变位点发生了由C到A的突变，其中野生型纯合体的基因型为CC，突变型杂合体的基因型为AC，突变型纯合体的基因型为AA。测序之后在该碱基位点处，不同基因型和左右碱基的峰值的相对高度各不相同，CC型峰值较高，AC型为两个杂峰混在一起，峰值较矮（图3），因为此次实验所用多趾北京油鸡均为杂合子，所以测序之后并没有突变型纯合体AA型的峰值结果。以上分析表明，通过测序的方法可以有效鉴别出不同条件下（生鸡肉和煮制、烤制、炸制熟鸡肉）的多趾北京油鸡肉和市售华都艾拔益加肉鸡肉。

图2 实验组和对照组PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图Fig. 2 Electrophoresis of PCR amplified products from raw and cooked meat samples from Beijing-you chicken and AA broiler

图3 实验组和对照组测序结果Fig. 3 Sequencing results of PCR amplified products from raw and cooked meat samples from Beijing-you chicken and AA broiler

PCR测序法简单快捷，可直接根据物种特异性序列进行PCR扩增然后进行测序鉴定[25]。Bottero等[16]通过设计线粒体12S rRNA基因的特异性引物进行PCR扩增得到234 bp和265 bp，鉴别热处理样品中猪肉、牛肉、绵羊肉、山羊肉、马肉、鸡肉、兔肉、鲑鳟鱼和欧洲的沙丁鱼。PCR产物经测序验证，其检测限达到0.0625%。测序鉴定是最直接最有效的PCR扩增产物的分析方法，它通常被用于对凝胶电泳和荧光定量PCR结果的确切分析。

2.2 PCR测序法和限制性酶切片段多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析法对生肉和熟肉样品的鉴定

图4 BsrDⅠ酶切位点Fig. 4 BsrDⅠrestriction sites

多趾北京油鸡在LMBR1基因（GenBank ID：NC_006089）的第5位内含子的第4645位发生了由C到A的突变，经过使用特定引物对实验组和对照组不同处理样品DNA进行扩增，得到含有该突变位点的扩增产物片段。本实验选用的是BsrDⅠ酶切扩增产物，其酶切序列如图4所示，其中箭头所指的位置是酶切位点，N代表任何碱基。根据图4可知，在突变位点的碱基为C时，BsrDⅠ能切断DNA，当该位点碱基为A时，BsrDⅠ不能切断DNA。酶切后将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，若电泳显示为2 条条带，则待测鸡只的基因型为CC型；若电泳显示为1 条条带，则待测鸡只的基因型为AA型；若电泳显示为3 条条带，则待测鸡只的基因型为AC型。基因型为CC的个体趾性状表现为4趾，检测结果为普通鸡肉；基因型为AA和AC的个体趾性状表现为多趾，检测结果为多趾北京油鸡肉。从而有效完成多趾北京油鸡肉的鉴别。本次实验提取实验组和对照组基因组DNA后，进行PCR扩增，用BsrDⅠ对扩增产物进行酶切后，琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示。

图5 实验组和对照组酶切产物琼脂糖凝胶电泳图Fig. 5 Electrophoresis of digestion products of PCR amplified genomic DNA from raw and cooked meat samples from Beijing-you chicken and AA broiler

由图5可知，实验组和对照组在经过65 ℃酶切4 h后，琼脂凝胶电泳的结果有很大的差别。其中多趾北京油鸡基因组DNA在LMBR1基因（GenBank ID：NC_006089）的第5内含子的第4645位发生了由C到A的突变，经过BsrDⅠ酶切后，其400 bp左右的扩增产物，被酶切为2 个片段，片段长度分别为200多个碱基对和100多个碱基对。根据电泳结果可知，本次实验所取的多趾北京油鸡均为突变型杂合体，其基因型为AC，酶切电泳结果为3 条条带；市售华都艾拔益加肉鸡基因型为野生型纯合体CC，酶切电泳结果为2 条条带，片段长度分别为200多个碱基对和100多个碱基对。通过实验组和对照组的酶切结果可以明显鉴别出多趾北京油鸡，且在不同热处理（煮制、烤制、炸制）下，酶切之后的电泳结果一致，说明PCR-RFLP分析法同PCR测序法一样，在鉴别检测过程中不受煮制、烤制或炸制处理的影响。

RFLP是根据是否存在特定限制性内切酶所识别的碱基位点而确定的。对于某一个内切酶来说，识别位点上碱基的突变、DNA片段上一个或者多个碱基对的插入、缺失或重组等，都可导致限制性片段的多态性[26]。限制性内切酶对特定序列的选择和扩增片段的长短影响PCR-RFLP分析法对物种的鉴别。目前PCR-RFLP技术在肉类鉴别中广泛应用，如冯海永等[27]在线粒体基因细胞色素b的DNA上设计出了羊（山羊、绵羊）和鸭的通用引物，然后分别用限制性内切酶SpeⅠ和Bsu36Ⅰ酶切鸭和羊的PCR产物，进行限制性片段长度多态性分析，该方法可作为一种对羊肉和鸭肉快速检测的简便易行的方法。Girish等[28]利用一对通用引物对禽类12S rRNA基因扩增后酶切，可以鉴别出鸡、鸭、火鸡、雉和鹌鹑。Wang qi等[29]把荧光标记引物检测和多种酶的酶切进行结合，成功鉴定了猪、狗、牛、山羊、绵羊、马、鸡、鼠、三文鱼和鹿等12 种常见物种。PCR-RFLP技术是一种可靠性高、重复性好且简便易行的物种鉴定技术，但其受到当前已知内切酶的种类和识别位点的限制，有时需要2 种或以上的内切酶进行酶切才能进行鉴别[30]。

3 结 论

PCR技术作为一种快速、精确的检测方法，在肉类鉴别中的应用越来越广泛。本实验通过应用PCR测序法和PCR-RFLP法，提取不同温度煮制、烤制以及炸制处理条件下多趾北京油鸡和市售华都艾拔益加肉鸡的DNA进行检测。其中PCR测序法通过使用软件DNAstar将测序结果进行对比，从而直接分析突变位点的基因完成鉴别；PCR-PFLP法通过实验组和对照组的酶切结果分析条带数间接确定突变位点的碱基，从而完成鉴别。这2 种方法在鉴别检测过程中不受煮制、烤制或炸制处理的影响，均可以有效完成对多趾北京油鸡肉的鉴别，为市售多趾北京油鸡肉的检测提供了理论依据。

本实验只能鉴别出多趾北京油鸡，无法鉴别全部的北京油鸡，只选择了华都艾拔益加肉鸡作为对照组，具有局限性。在该方法结果的基础上探索普通北京油鸡与其他鸡品种的区别，从而完成进一步的鉴别。另外酶切条件在实验中特别重要，之后应再补充实验进一步优化酶切条件，在缩短实验时间达到快速检测的同时，保证对照组可以被充分酶切。

PCR检测方法具有精确、快速、操作简单、节省费用等优点，已经逐渐成为肉类产品检测的主要方法。目前还有很多以PCR技术为基础对肉的品种进行鉴别的研究，更加快速、简便的物种鉴别新方法也会陆续出现，肉制品的安全性也会大大提高。

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Identification of Multi-Toed Beijing-You Chicken by PCR

CHEN Jingru1, XIA Haijian2, ZHANG Zebin2, QU Lujiang2, LIU Yi1, LI Xingmin1,*
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China;2. College of Animal Science & Technology, China Agricultural University, Beijing 100094, China)

Beijing-you chicken is one of the precious local breeds in China. In the natural population, there are some multitoed individuals because of the mutation of C-G base pair to an A-U pair at the 246 bp site in the LMBR1 gene. In this study,the genotype of multi-toed Beijing-you chicken was found to be different from that of Huadu Arbor Acres (AA) broiler, and the mutated base pair (A-U or C-G) was determined by PCR sequencing and restriction fragment polymorphism (RFLP) so that the breeds could be accurately discriminated from each other.

Beijing-you chicken; Huadu Arbor Acres broiler; polydactly; PCR sequencing; restriction fragment polymorphism

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724037

TS253.1

A

1002-6630（2017）24-0229-06

陈静茹, 夏海剑, 张泽宾, 等. PCR技术鉴别多趾北京油鸡肉[J]. 食品科学, 2017, 38(24): 229-234.

10.7506/spkx1002-6630-201724037. http://www.spkx.net.cn

CHEN Jingru, XIA Haijian, ZHANG Zebin, et al. Identification of multi-toed Beijing-you chicken by PCR[J]. Food Science,2017, 38(24)∶ 229-234. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724037. http∶//www.spkx.net.cn

2017-02-27

北京市家禽产业创新团队项目（BAIC04-2017）

陈静茹（1994—），女，硕士研究生，研究方向为农产品加工及贮藏。E-mail：chenjingru@cau.edu.cn

*通信作者：李兴民（1964—），男，副教授，本科，研究方向为农产品加工及贮藏。E-mail：lixingmin@cau.edu.cn