甘氨酸的抑菌作用分析

2016-12-13廖夏云黄小云冯丽敏聂红梅池明亮广西中医药大学

食品安全导刊 2016年33期

□ 廖夏云　黄小云　冯丽敏　聂红梅　池明亮　谭　强　广西中医药大学

甘氨酸的抑菌作用分析

□ 廖夏云黄小云冯丽敏聂红梅池明亮谭强广西中医药大学

甘氨酸可作为营养补充剂和调味剂应用于食品中，还具有一定的抑菌效果。本文通过研究甘氨酸在不同的条件下对大肠杆菌(Escherichia coli，以下简称E.coli)和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，以下简称Sa）的抑菌活性，确定甘氨酸对这两种食品中常见的致病菌的最佳的抑制条件。用微量肉汤稀释法，测定在不同的浓度、不同pH值、不同时间的条件下，甘氨酸对E.coli和Sa的抑菌率，确定最佳的抑菌条件。通过单因素实验研究表明甘氨酸对E.coli的最佳抑菌条件：浓度为2.0%（g/mL)，pH为7，时间为20 h，抑菌率为100%。甘氨酸对Sa的最佳抑菌条件：浓度为2.5%（g/mL)，pH为5，时间为16 h，抑菌率为100%。甘氨酸对Sa和E.coli均具有良好的抑制作用，对E.coli的抑制效果更好。

甘氨酸，抑菌，微量肉汤稀释法

甘氨酸（Glycine），又名氨基乙酸（C2H5N O2），在氨基酸中结构最简单，为人体非必需氨基酸。甘氨酸为白色单斜晶系的晶体或白色性结晶粉末，无臭、无毒、易溶于水[1]，甜度为蔗糖的0.8倍。大鼠口服半数致死量LD50是7.93 g/kg[2]。

目前，谷氨酸钠（味精）和甘氨酸是全世界用量最大的调味品。甘氨酸因具有抗氧化作用而被添加到奶油、干酪、人造奶油中，能延长保质期3～4倍，在火腿、腊肠、鱼肉、花生酱等食品中添加1%～2%的甘氨酸能达到防臭和防腐的效果[3]，甘氨酸还用于配制运动员的营养饮料及其氨基酸食品，食用添加甘氨酸的食品对人体胃液酸度的调节、肌肉活力的提高有一定作用[4-7]。

我国允许使用的防腐剂有30多种，但安全无毒、经济实用、抑菌广泛并适用于各种食品的理想防腐剂仍然很少。甘氨酸来源丰富，对动物的毒性很低，同时几乎不对人体产生毒性，因此可作为一种非特异性防腐剂。石春芝等[8]对甘氨酸的抑菌作用研究表明，3%的甘氨酸对坚强芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌抑菌的作用非常明显，甘氨酸与低级脂肪酸合并使用时对引起豆腐腐败的微生物有显著的抑菌作用。在席晓岚等人的研究报道中，用4-硝基苯甲醛与甘氨酸反应合成Schiff碱，抑菌试验结果表明，该化合物对红色毛癣菌、孢子丝菌、白色念珠菌均有不同程度的抑菌活性作用[9]。

如何既防止食品的腐败变质，又满足消费者对防腐剂安全无毒、经济有效的要求是目前研究的热点，甘氨酸既具有防腐作用，又有营养和改善食品风味等作用，这样的天然防腐剂的研究和开发利用是食品科学工业的一个新方向。本文采用微量肉汤稀释法，探究在不同浓度、pH值、时间的条件下甘氨酸对大肠杆菌（E.coli）和金黄色葡萄球菌（Sa）的最佳抑制条件，扩展对甘氨酸抑菌作用的环境和条件的研究，进一步了解甘氨酸的抑菌作用效果。

1　实验材料及方法

1.1材料与仪器

金黄色葡萄球菌CICC 10384，由广西中医药大学第一附属医院提供；大肠杆菌CICC 10419，购于中国工业微生物菌种保藏中心；M ueller-Hinton Broth，北京陆桥技术有限公司；琼脂，国药集团化学试剂有限公司；甘氨酸，分析级，含量不少于99.0%，天津市光复精细化工研究所。

752N紫外分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；JJ200电子天平，常熟市双杰测试仪器厂；LRH-250-S恒温培养箱，韶关市泰宏医疗器械有限公司；DHG-9503A电热恒温鼓风干燥箱，上海柏欣仪器设备厂；VS-840K-U洁净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；YXQ-LS-50SII立式蒸汽压力灭菌柜，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；JB-3恒温定时搅拌器，上海雷磁创益仪器仪表有限公司；XW-80A旋涡混合器，江苏海门市麒麟医用仪器厂；DK-98-11电子调温万用炉，天津市泰斯特仪器有限公司；TP8D300H移液枪，TO PSCIEN；Biotek Epoch全波长酶标仪。

1.2实验方法

1.2.1溶液制备

配制浓度为0.2 g/m L的甘氨酸溶液，分别用醋酸缓冲液调节pH至4、5，用磷酸盐缓冲液调节pH至6、7、8、9，放入冰箱保存，备用。

1.2.2培养基的制备

M HB固体培养基：称取M HB培养基12.5 g，加入琼脂7.5 g，蒸馏水500 m L，溶解，分装，煮至清澈透明，121 ℃高压灭菌15 m in，备用。

M HB液体培养基：称取M HB培养基12.5 g，加入蒸馏水500 m L，溶解，分装，煮至清澈透明，121 ℃高压灭菌15 m in，备用。

1.3甘氨酸在不同浓度、pH值、时间下的抑菌作用

1.3.1浓度对抑菌效果的影响

取洁净无菌的96孔板，8列（1～8）×12行（A～L），pH=7的甘氨酸储备液和液体培养基、菌液。

96孔板1～8列加入顺序见表1，A～D行加入E.coli菌液，E～H行加入Sa菌液，加入完毕后，将96孔板放入恒温培养箱中，培养温度为37 ℃，14 h后取出，用酶标仪测定O D620值，计算抑菌率。

1.5.2pH值对抑菌效果的影响

以1.5.1中对抑菌效果显著的最低浓度为最佳抑菌浓度，参照表1在96孔板中加入pH值分别为5、6、7、8、9的该浓度甘氨酸储备液，加入相应的无菌水、液体培养基和菌液，放入37 ℃恒温培养箱中培养14 h后，取出，用酶标仪测定O D620值，计算抑菌率。

1.5.3抑菌时间对抑菌效果的影响

将1.5.2中抑菌效果最佳的处理再放回37 ℃恒温培养箱中培养，每隔2 h测定O D620值，即记录14、16、18、20 h和22 h时，在最佳抑菌浓度、最佳抑菌pH值条件下，甘氨酸的抑菌率随时间的变化情况。

1.5.4抑菌率计算方法

抑菌率按照公式（1）计算：

当实验O D值大于阳性对照O D值时，抑菌率记为0.0%；当实验O D值小于阴性对照O D值时，抑菌率记为100.0%。

2　实验结果与讨论

2.1不同浓度甘氨酸的抑菌效果

浓度为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的甘氨酸对E.coli的抑菌率分别为0.0%、37.4%、76.1%、100.0%和100.0%，如图1所示。由图1可知，随着甘氨酸浓度的增加，对E.coli的抑制作用增强，甘氨酸浓度到达2.0%后，甘氨酸对E.coli的抑菌率达100%。甘氨酸浓度为0.5%时，对E.coli没有抑菌作用，甘氨酸属于氨基酸，是E.coli良好的营养物质，此时E.coli将甘氨酸作为营养物质吸收；浓度为1.0%时，甘氨酸开始抑制E.coli，当浓度到2.0%时，抑菌率为100.0%，抑菌效果最佳，浓度升高到2.5%，抑菌率同样为100%，说明浓度达到2.0%后甘氨酸对E.coli都有很好的抑制作用。

表1　甘氨酸的抑菌浓度

图1　pH为7的甘氨酸对E.coli的抑制作用

测定浓度为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的甘氨酸对Sa的抑制作用，得到抑菌率分别为0.0%、0.0%、2.6%、55.9%、100.0%、100.0%，如图2所示。由图2可知，随着甘氨酸浓度的增加，对Sa的抑制作用增强，当甘氨酸浓度达到2.5%时，甘氨酸对Sa的抑菌率达到100%。甘氨酸浓度为0.5%、1.0%时，对Sa没有抑菌作用，此时Sa以甘氨酸为营养物质；浓度为1.5%时，甘氨酸开始对Sa产生抑制作用，当浓度到2.5%时，抑菌率为100.0%，抑菌效果最佳，浓度升高到3.0%，抑菌率同样为100.0%，说明当浓度到达2.5%时，甘氨酸对Sa有很好的抑制作用。

图2　pH为7甘氨酸对Sa的抑制作用

甘氨酸可作为微生物的良好氮源，对E.coli和Sa是营养物质，因此甘氨酸浓度过低则无法很好地抑制E.coli和Sa的生长，浓度过高则成本增加，并且对于氨基酸含量丰富的食品，添加的甘氨酸过量还可能会导致人体对营养吸收不平衡，因此甘氨酸对E.coli的最佳抑制浓度应选择2.0%，对Sa的最佳抑制浓度应选择2.5%。

2 2 不同pH值甘氨酸的抑菌效果

设置浓度为2.0%，pH值分别为5、6、7、8和9的甘氨酸溶液，测定其对E.coli的抑制作用效果，抑菌率分别为95.2%、98.1%、100.0%、100.0%、96.7%，如图3所示。由图3可知甘氨酸在pH 5～9范围内对E.coli都有良好的抑菌效果，且抑菌率差异不明显，表明甘氨酸在pH 5～9的范围内都有抑菌作用。

图3　2.0%甘氨酸对E.coli的抑制作用

设置浓度为2.5%，pH值分别为5、6、7、8和9的甘氨酸溶液，测定其对Sa的抑制作用效果，抑菌率分别为100.0%、92.4%、98.1%、97.0%、86.9%，如图4所示。由图4可知，甘氨酸在pH 5～9的范围内对Sa都有较好的抑菌效果，除pH=9的甘氨酸外，其他甘氨酸抑菌均抑菌率超过90.0%，且差异不明显，表明甘氨酸在pH 5～8的范围内对Sa有良好抑菌作用，pH=9的甘氨酸抑菌效果稍差。

图4　2.5%甘氨酸对Sa的抑制作用

甘氨酸在pH值为5～9的范围内对E.coli的抑制率均达到95.0%以上，对Sa的抑制率均达到85.0%以上，表明甘氨酸在较宽的pH值范围内对E.coli和Sa有广泛的抑制作用。由图3可知，甘氨酸在pH值为7或8时，对E.coli的抑菌效果最佳，由图4可知甘氨酸在pH为7时抑菌率为98.1%，pH值为8时为97.0%，pH为7比pH为8抑菌更好，综合考虑，甘氨酸对E.coli的最佳抑菌的pH应为7。由图4可知甘氨酸的pH值为5时对Sa的抑菌效果最佳，因此甘氨酸对Sa的最佳抑菌pH为5。

2.3不同时间甘氨酸的抑菌效果

选择甘氨酸浓度为2.0%，pH值为7，设置14、16、18、20 h和22 h 5个不同的培养时间，测定甘氨酸对E.coli的抑制效果，得到的抑菌率分别为100.0%、95.4%、100.0%、100.0%、98.3%，如图5所示。由图5可知，甘氨酸对E.coli的抑制作用随着培养时间的增加，甘氨酸对E.coli的抑菌率没有明显变化，即甘氨酸在5个培养时间里对E.coli都有良好的抑制效果，且5个时间里的抑菌率差异不明显，表明甘氨酸在14～22 h内对E.coli有良好的抑菌效果。

图5　浓度为2.0%，pH值为7的甘氨酸对E.coli的抑制作用

选择浓度为2.5%，pH值为5的甘氨酸，设置14、16、18、20 h和22 h 5个不同的培养时间，测定甘氨酸对Sa的抑制效果，得到的抑菌率分别为100.0%、100.0%、96.4%、91.1%、92.0%，如图6所示。由图6可知，甘氨酸对Sa的抑制作用随着培养时间的增加逐渐减弱，当时间到16 h时，抑菌率为100.0%，16 h后抑菌率降低，说明培养时间在16 h内甘氨酸对Sa的抑制效果很好。甘氨酸在设置的5个培养时间里对Sa都有良好的抑制效果，并且五个时间里的抑菌率差异不明显，表明甘氨酸在14～16 h内对Sa有良好的抑菌效果。

图6　浓度为2.5%，pH值为5的甘氨酸对Sa的抑制作用

甘氨酸在较长的时间内对E.coli和Sa的抑制作用达到90.0%以上，呈现出较好的抑菌效果，表明甘氨酸能在较长的时间范围内起到良好的抑菌作用。

3　结论

通过测定不同浓度、pH值和时间的甘氨酸对E.coli和Sa这两种细菌的抑菌率，确定甘氨酸浓度为2.0%，pH为7，培养14～22 h时，对E.coli的抑制作用最佳；甘氨酸浓度为2.5%，pH值为5，培养时间在16 h内对Sa的抑制最佳。甘氨酸对E.coli和Sa都有较好的抑制作用。

对比不同浓度甘氨酸对E.coli和Sa的抑制作用，较低的甘氨酸浓度即可抑制E.coli的生长繁殖，说明E.coli对甘氨酸更为敏感。对比甘氨酸在pH值在5～9的范围内对E.coli和Sa的抑制作用，pH的变化对E.coli和Sa的抑制效果影响不大。对比培养时间对E.coli和Sa的抑制作用，在22h内甘氨酸对E.coli的抑制效果变化较小，在16 h后对Sa的抑制作用随着时间的延长而减弱，说明甘氨酸对E.coli的抑制时间更为长久。