葵花籽粕酶法制备多肽的湿热预处理研究

郭婷婷，万楚筠，黄凤洪，曾 涛

(1.中国农业科学院 油料作物研究所, 武汉430062； 2.油料脂质化学与营养湖北省重点实验室, 武汉430062； 3.油料油脂加工技术国家地方联合工程实验室, 武汉430062； 4.农业部油料作物生物学 与遗传育种重点实验室, 武汉430062)

油料蛋白

葵花籽粕酶法制备多肽的湿热预处理研究

郭婷婷1,3，万楚筠1,3，黄凤洪1,4，曾 涛2,4

(1.中国农业科学院 油料作物研究所, 武汉430062； 2.油料脂质化学与营养湖北省重点实验室, 武汉430062； 3.油料油脂加工技术国家地方联合工程实验室, 武汉430062； 4.农业部油料作物生物学 与遗传育种重点实验室, 武汉430062)

以葵花籽粕为原料，以氮得率和热处理物总氮含量为评价指标，通过单因素试验分别研究pH、过筛目数、料液比、处理时间对葵花籽粕酶法制备多肽湿热预处理的影响。在此基础上，利用正交试验进行工艺优化得到湿热预处理最佳工艺条件为：pH 4.0，过筛目数60目，料液比1∶10，处理时间5 min。在最佳条件下，氮得率为98.14%，热处理物总氮含量为10.16%。

葵花籽粕；湿热处理；酶解；预处理

葵花籽榨取油脂后的籽粕中含有丰富的蛋白质，含量为29%～43%[1]。葵花籽蛋白经水解后可制得复合多肽。饼粕多肽在抗氧化[2]、抗肿瘤[3]及降血脂[4]等方面有较高的生物活性。目前可以完全实现产业化的活性多肽的制备方法是酶解法。但由于蛋白质分子高度压缩，酶敏感性差，很大程度上限制了酶解反应速率。近年来研究表明，利用超声对菜籽蛋白进行预处理，可显著提高蛋白质水解度[5]。超声波对蛋白质的三级和四级结构有破坏作用，但对其二级结构影响较小[6]。利用双螺杆膨化机进行膨化加工时，膨化腔的高温、瞬时高压以及剪切力都会导致蛋白质变性。蛋白质变性之后表面疏松多孔，使蛋白酶更容易进入蛋白质的内部，对蛋白质的水解有促进作用[7]，但膨化处理会影响产物品质风味。高速剪切[8]、高静水压[9]等均可使蛋白质空间结构和理化性质发生改变，但设备要求高、处理较复杂，限制了其在工业上的推广应用。基于此，本文采用设备投资少、操作简单的湿热处理手段对葵花籽粕原料进行预处理并优化工艺条件，以期为葵花籽粕高值化利用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

葵花籽粕：水分、总氮含量、粗脂肪含量分别为8.50%、7.58%、1.66%。

碱性蛋白酶，购于诺维信生物技术有限公司；氢氧化钠、盐酸、三氯乙酸均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

PB-10 pH计：德国赛多利斯股份公司；Avanti J-26离心机：赛默飞世尔科技有限公司；Foss Kjeltec 2300型凯氏定氮自动分析仪：丹麦福斯分析有限公司；GX-25型多功能粉碎机：浙江高鑫工贸有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 葵花籽粕多肽制备工艺的筛选

按1∶10料液比加入蒸馏水①→调pH至4.0②→沸水浴加热搅拌15 min③→离心，收集沉淀④→等体积蒸馏水洗渣⑤→按1∶15料液比加蒸馏水⑥→调pH至8.5⑦→加5 000 U/g碱性蛋白酶，60℃保温⑧→反应2 h⑨→离心，收集上清液，测其氮得率、三氯乙酸氮溶解指数(TCA-NSI)、水解度(DH)⑩。

制备工艺(1)：⑥→⑦→⑧→⑨→⑩

制备工艺(2)：①→③→④→⑥→⑦→⑧→⑨→⑩

制备工艺(3)：①→②→③→④→⑥→⑦→⑧→⑨→⑩

制备工艺(4)：①→②→③→④→⑤→⑥→⑦→⑧→⑨→⑩

制备工艺(5)：①→②→③→④→⑥→⑦→⑨→⑩

制备工艺(6)：①→②→③→④→⑥→⑧→⑨→⑩

1.2.2 葵花籽粕湿热预处理

称取葵花籽粕原料，按照一定料液比加入蒸馏水，调pH，水浴加热搅拌，离心(10 000 r/min, 10 min)，收集上清液和沉淀，取沉淀干燥，得到干燥固体，即热处理物。测其热处理物总氮含量，按下式计算氮得率。

1.2.3 单因素试验设计

在湿热预处理过程中，分别研究不同过筛目数(40、50、60、80、100目)、料液比(1∶5、1∶7.5、1∶10、1∶12.5、1∶15)、处理时间(5、10、15、20、25 min)、pH(2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、7.0、9.0、11.0)对氮得率、热处理物总氮含量的影响。单因素试验中各因素的固定水平分别为过筛目数60目，料液比1∶12.5，pH 7.0，处理时间15 min。

1.2.4 水解度测定

参照尚新彬等[10]的方法测定水解度。

1.2.5TCA-NSI测定

参照Chavan等[11]的方法测定TCA-NSI。

2 结果与分析

2.1 不同制备工艺对葵花籽粕酶解的影响(见图1)

图1 不同制备工艺对葵花籽粕酶解的影响

由图1可知，不同制备工艺对酶解结果影响较大，经湿热处理的酶解效果优于未湿热处理的，其中调pH后的湿热处理效果明显优于未调pH的湿热处理。加热可破坏氢键、范德华力等次级键，使蛋白质成为松散的结构，改变蛋白质的功能性质[12]。在湿热处理中，必须掌握好适当的处理程度，否则会使已变性的蛋白质分子因疏水作用力或二硫键形成致密网状结构，酶结合位点反而被包埋[13-14]。比较制备工艺(5)、(6)可发现，添加蛋白酶酶解效果优于不添加酶的效果。这是因为对于酶解过程，葵花籽粕内源酶对原料蛋白有酶解作用，但远小于加入外源酶的作用效果。比较制备工艺(3)、(4)、(6)可知酶解后的洗渣对酶解效果影响较小，但酶解过程pH对酶解效果影响较大。故制备工艺(3)为葵花籽粕多肽制备较为理想工艺过程。即对原料进行湿热预处理后再酶解的方法制备多肽。

2.2 葵花籽粕酶法制备多肽的湿热预处理单因素试验

2.2.1 pH对氮得率及热处理物总氮含量的影响(见图2)

图2 pH对氮得率、热处理物总氮含量的影响

由图2可知，随着pH的增大，湿热预处理氮得率及热处理物总氮含量均先增大后降低，当pH为4.0时均达到最大值，分别为98.23%、10.16%。这是由于pH 4.0为葵花籽蛋白等电点[15]，此时蛋白质溶解度最小，即离心所得固体中可收集到最多蛋白质；超过等电点后，可溶性蛋白较多溶出导致氮得率、总氮含量降低。故选用pH 3.0、4.0、4.5为3个水平做正交试验。

2.2.2 过筛目数对氮得率及热处理物总氮含量的影响(见图3)

图3 过筛目数对氮得率、热处理物总氮含量的影响

由图3可知，湿热预处理氮得率随葵花籽粕原料过筛目数的增大呈先减小后增大趋势，热处理物总氮含量反之。这主要是因为过筛目数较小，粒径较大，其比表面积较小，原料与溶剂的接触面积较小，不利于可溶性物质的溶出，热处理物总氮含量较高，氮得率较低；而粒径较小时容易聚集成块，相同条件下不易充分搅拌，且原料中可溶物易粘附在沉淀表面，不利于分离。结果显示当过筛目数为60目时，热处理物总氮含量达到最大值，故选择50、60、80目为3个水平做正交试验。

2.2.3 料液比对氮得率及热处理物总氮含量的影响(见图4)

由图4可知，随着料液比的增大，热处理物总氮含量逐渐增大，在1∶12.5达到最大10.21%，之后变化不大，而氮得率逐渐降低至90.15%，之后趋于平缓。料液比较小时，原料与溶剂接触不充分，可溶物的溶出减少；随着料液比增大，二者之间充分接触，可溶物溶出增大。考虑到工业上后期废水处理难度大、成本高，故选用1∶5、1∶7.5、1∶10为3个水平做正交试验。

图4 料液比对氮得率、热处理物总氮含量的影响

2.2.4 处理时间对氮得率及热处理物总氮含量的影响(见图5)

图5 处理时间对氮得率、热处理物总氮含量的影响

由图5可知，湿热预处理氮得率随着处理时间的延长而逐渐降低。当处理时间为5 ～ 15 min时，热处理物总氮含量提高，20 min后降低趋于平缓。处理刚开始时原料中非蛋白质成分和可溶蛋白还未溶出，热处理物总氮含量较低；随着处理时间的延长，可溶成分扩散逐渐达到过渡阶段以及慢速传质阶段，扩散达到动态平衡之后，指标变化趋于平缓。综合考虑湿热处理经济效益，选择5、10、15 min为3个水平做正交试验。

2.3 葵花籽粕酶法制备多肽的湿热处理正交试验

在单因素试验基础上，以pH、过筛目数、料液比、处理时间进行正交试验，以氮得率、热处理物总氮含量为评价指标，正交试验因素水平见表1，正交试验设计及结果见表2，方差分析见表3、表4。

表1 因素水平

表2 正交试验设计及结果

表3 氮得率的方差分析

表4 热处理物总氮含量的方差分析

由表2、表3可知，pH对氮得率有极显著影响(Plt;0.01)，过筛目数有显著影响(Plt;0.05)。以氮得率为评价指标，湿热预处理的最佳工艺条件为A2B2C3D3，即pH 4.0，过筛目数60目，料液比1∶10，处理时间15 min。由表2、表4可知，pH对热处理物总氮含量有极显著影响(Plt;0.01)。以热处理物总氮含量为评价指标，湿热预处理的最佳工艺条件为A2B2C3D1，即pH 4.0，过筛目数60目，料液比1∶10，处理时间5 min。考虑到处理时间对氮得率无显著影响以及工业生产效益，确定湿热预处理时间为5 min。通过验证试验得到此条件下氮得率为98.14%，热处理物总氮含量为10.16%。

3 结 论

采用湿热处理对葵花籽粕原料进行预处理，通过正交试验极差分析和方差分析可知处理工艺中各因素对处理结果的影响主次顺序为：pHgt;过筛目数gt;料液比gt;处理时间。当pH 4.0、过筛目数60目、料液比1∶10、处理时间5 min时，湿热预处理氮得率为98.14%，热处理物总氮含量为10.16%。

[1] 董聪, 李芳, 王琳,等. 双酶酶解葵花籽粕蛋白制备抗氧化多肽的研究[J]. 食品工业科技, 2015, 36(11):116-121.

[2] JIAN R, ZHENG X Q, LIU X L, et al. Purification and characterization of antioxidant peptide from sunflower protein hydrolysate[J]. Food Technol Biotech, 2010, 48(4):519-523.

[3] DE LUMEN B O. Lunasin: a novel cancer preventive seed peptide that modifies chromatin[J]. J AOAC Int, 2008, 91(4):932-935.

[4] VELASQUEZ M T, BHATHENA S J. Role of dietary soy protein in obesity[J]. Int J Med Sci, 2007, 4(2):72-82.

[5] CHEN L, CHEN J, REN J, et al. Effects of ultrasound pretreatment on the enzymatic hydrolysis of soy protein isolates and on the emulsifying properties of hydrolysates[J]. J Agric Food Chem, 2011, 59(6):2600-2609.

[6] 陈林, 吴克刚, 柴向华,等. 物理预处理改善食品蛋白酶解特性的研究进展[J]. 食品与发酵工业, 2013, 39(10):181-186.

[7] 田珍珍, 李国军, 赵文恩,等. 不同水分添加量对膨化菜粕品质的影响研究[J]. 饲料工业, 2015, 36(3): 32-36.

[8] 黄国平, 孙春凤, 陈慧卿,等. 大豆分离蛋白萃取与性能改善工艺研究进展[J]. 食品工业科技, 2012, 33(17):398-404.

[9] ZHOU H, WANG C Z, YE J Z, et al. Effects of enzymatic hydrolysis assisted by high hydrostatic pressure processing on the hydrolysis and allergenicity of proteins from Ginkgo seeds[J]. Food Bioprocess Tech, 2016,9(5):839-848.

[10] 尚新彬, 王富刚, 豆康宁. 花生肽抗氧化性及抗氧化稳定性的研究[J]. 中国油脂, 2015, 40(2):33-36.

[11] CHAVAN U D, MCKENZIE D B, SHAHIDI F. Functional properties of protein isolates from beach pea (LathyrusmaritimusL.)[J]. Food Chem, 2001, 74(2):177-187.

[12] 陈珂玥, 任健. 热处理对葵花分离蛋白功能性质的影响[J]. 食品工业, 2015(7):183-185.

[13] LE G M, GUÉGUEN J, SÉVE B, et al. Effects of grinding and thermal treatments on hydrolysis susceptibility of pea proteins (PisumsativumL.)[J]. J Agric Food Chem, 2005, 53(8):3057-3064.

[14] YIN S W, TANG C H, CAO J S, et al. Effects of limited enzymatic hydrolysis with trypsin on the functional properties of hemp (CannabissativaL.) protein isolate[J]. Food Chem, 2008, 106(3):1004-1013.

[15] 罗丰收. 葵花籽粕蛋白萃取及其改性研究[D]. 乌鲁木齐：新疆农业大学, 2014.

Optimizationofmoistheatpretreatmentofsunflowerseedmealforenzymaticpreparationofpolypeptide

GUO Tingting1,3, WAN Chuyun1,3， HUANG Fenghong1,4, ZENG Tao2,4

(1. Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences,Wuhan 430062,China； 2. Hubei Key Laboratory of Lipid Chemistry and Nutrition, Wuhan 430062,China； 3. Oil Crops and Lipids Process Technology National amp; Local Joint Engineering Laboratory, Wuhan 430062,China； 4. Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062,China)

With sunflower seed meal as raw material, yield of nitrogen and total nitrogen content of heat treatment material as evaluation indicator, the effects of pH, sieve mesh, ratio of solid to liquid and treatment time on the moist heat pretreatment of sunflower seed meal for enzymatic preparation of polypeptide were studied by single factor experiment. And the conditions were optimized by orthogonal experiment as follows: pH 4.0, sieve mesh 60 meshes, ratio of solid to liquid 1∶10, treatment time 5 min. Under the optimal conditions, the yield of nitrogen was 98.14%, and the total nitrogen content of heat treatment material was 10.16%.

sunflower seed meal; moist heat treatment; enzymolysis; pretreament

TS201.2;TS229

A

1003-7969(2017)11-0061-04

2017-02-07；

2017-07-19

国家自然科学基金(31501409)；中国农业科学院科技创新工程(CAAS-ASTIP-2013-OCRI)；公益性行业(农业)科研专项(201303072)

郭婷婷(1989)，女，硕士，研究方向为粮油加工与利用(E-mail) tingtingguo23@sina.com。

万楚筠，科研助理，博士(E-mail)tomwan@vip.qq.com。