水合法提取罗非鱼鱼油及其脂肪酸组成分析

李 雪，曹 君，白新鹏，姜泽放，刘少杰，李 宁(海南大学 食品学院，生物活性物质与功能食品开发重点实验室,海口570228)

水合法提取罗非鱼鱼油及其脂肪酸组成分析

李 雪，曹 君，白新鹏，姜泽放，刘少杰，李 宁
(海南大学 食品学院，生物活性物质与功能食品开发重点实验室,海口570228)

以冻干的罗非鱼粉为原料，采用酶解法和稀碱水解法分别提取罗非鱼鱼油，通过单因素试验和正交试验，确定两种水合法的最佳工艺条件，并采用气相色谱法分析罗非鱼鱼油脂肪酸组成。结果表明：稀碱水解法提取罗非鱼鱼油最佳工艺条件为料液比1∶3、pH 7.5、水解时间30 min、盐析量2.5%、盐析时间25 min、水解温度65℃；酶解法提取罗非鱼鱼油最佳工艺条件为料液比1∶3、加酶量0.6%、pH 9、酶解温度55℃、酶解时间2 h；在最佳工艺条件下，稀碱水解法的提油率为(32.13±0.07)%，略高于酶解法的(28.91±0.18)%；稀碱水解法提取罗非鱼鱼油n-3不饱和脂肪酸含量为(5.192±0.280)%，高于酶解法的(4.991±0.099)%。

罗非鱼；鱼油；酶解法；稀碱水解法；脂肪酸

罗非鱼，又名非洲鲫鱼，适应能力较强，可在淡水和海水中生存，为杂食性鱼类。目前我国广州和海南的罗非鱼养殖规模较大，约占全国的1/3[1]。罗非鱼肉肥、刺少，是目前较为物美价廉的鱼类，被世界营养协会誉为“未来动物性蛋白质的主要来源之一”。 随着人们对营养和保健的日益重视，鱼油作为功能性油脂日益受到广泛关注。鱼油富含多不饱和脂肪酸及脂溶性维生素等，可改善视力、健脑益智、降低血压、降低胆固醇等[2-5]。目前鱼油提取方法主要为机械法、水合法(蒸煮法、酶解法、稀碱水解法)和超临界流体萃取法等[6]。机械法主要采用物理压榨制取鱼油，出油率较低，且压榨过程中，蛋白质变性，但由于操作方法简单，设备要求较低，是目前应用最为广泛的鱼油提取方法。蒸煮法相较其他水合法而言，提取率较低，产品质量较差，原料浪费较严重。超临界流体萃取法是近年新型的萃取分离技术，对设备要求较高，不易大规模生产。

在传统研究中，通常是将鲜鱼进行简单的清洗晾干，然后提取鱼油。然而，该方法难以保证原料含水量的均一性。因此，本试验采用冷冻干燥法预先处理原料，然后分别用酶解法和稀碱水解法提取罗非鱼粉中的鱼油，采用单因素试验和正交试验以确定两种方法的最佳提油工艺，并对罗非鱼鱼油脂肪酸组成进行对比分析，为进一步科学地综合利用罗非鱼提供新途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜罗非鱼：海口市售，重约1.5 kg，长约25 cm，宽约14 cm。

碱性蛋白酶：源叶生物；氢氧化钾、石油醚(沸程60～90℃)、硝酸钾：分析纯。

FDU-2100冷冻干燥机，GL-20G-II型高速冷冻离心机，SHZ-B恒温水浴振荡器，EV321旋转蒸发仪，JM-B20002电子天平。

1.2 试验方法

1.2.1 原料处理

罗非鱼洗净，晾干，去掉苦胆，切块，在-18℃冰箱中冷冻24 h，放入真空冷冻干燥机，-80℃下，冻干48 h，粉碎，放入样品袋，密封，存放于-80℃冰箱中待用。

1.2.2 稀碱水解法提取罗非鱼鱼油

取罗非鱼鱼粉30 g，加入适量去离子水，调节料液比，加入质量分数10%的氢氧化钾溶液调节pH，将样品放入水浴摇床中，在一定水解温度下水解一定时间，再加入适量硝酸钾，恒温水浴盐析一定时间，然后趁热离心(8 000 r/min，10 min)，取上层液虹吸，抽滤，滤纸用石油醚冲洗，旋转蒸发至恒重，旋蒸瓶内油脂即为罗非鱼粗鱼油，称重，计算罗非鱼提油率。

罗非鱼提油率=提取鱼油质量/罗非鱼鱼粉质量×100%

1.2.3 酶解法提取罗非鱼鱼油

取罗非鱼鱼粉30 g，加入适量去离子水，调节料液比，加入质量分数10%的氢氧化钾溶液调节pH，然后加入适量碱性蛋白酶，将样品放入恒温水浴摇床中，在一定酶解温度下酶解一定时间，结束后95℃水浴10 min灭酶，然后离心(8 000 r/min，10 min)，取上层液虹吸，抽滤，滤纸用石油醚冲洗，旋转蒸发至恒重，旋蒸瓶内油脂即为罗非鱼粗鱼油，称重，计算罗非鱼提油率。

1.2.4 气相色谱分析罗非鱼鱼油脂肪酸组成

参照文献[7]的方法测定罗非鱼鱼油脂肪酸组成。

1.2.5 数据处理

所有试验进行3次平行试验，应用Origin9.0软件进行分析作图。

2 结果与分析

2.1 稀碱水解法提取罗非鱼鱼油

2.1.1 单因素试验

2.1.1.1 料液比对提油率的影响

在pH 8、水解温度55℃、水解时间30 min、盐析量3%、盐析时间15 min条件下，研究料液比对提油率的影响，结果见图1。

图1 料液比对提油率的影响

从图1可以看出，提油率随着料液比的增加先增大后下降。在料液比为1∶2.5时，提油率达到最大值26.78%，之后提油率开始大幅下降。原因可能是随着料液比的增加，去离子水含量增大，稀释碱浓度，影响碱的作用[8]。

2.1.1.2 pH对提油率的影响

在料液比1∶3、水解温度55℃、水解时间30 min、盐析量3%、盐析时间15 min条件下，研究pH对提油率的影响，结果见图2。

图2 pH对提油率的影响

从图2可以看出，随着pH的增大，碱性环境对蛋白质与鱼油结合的破坏更加充分，使提油率逐渐增大。在pH 8时，提油率达到最大值26.94%。而当pH大于8时，鱼油皂化现象严重，提油率逐渐降低，也可能是因为pH过高，促使鱼油水解成游离脂肪酸[9]。

2.1.1.3 水解时间对提油率的影响

在料液比1∶3、pH 8、水解温度55℃、盐析量3%、盐析时间15 min条件下，研究水解时间对提油率的影响，结果见图3。

图3 水解时间对提油率的影响

从图3可以看出，随着水解时间的延长，提油率增大，在水解时间为30 min时达到最大值25.4%，之后随着水解时间的延长，鱼油的氧化分解等反应加剧，提油率降低。

2.1.1.4 水解温度对提油率的影响

在料液比1∶3、pH 8、水解时间30 min、盐析量3%、盐析时间15 min条件下，研究水解温度对提油率的影响，结果见图4。

图4 水解温度对提油率的影响

从图4可以看出，提油率随水解温度的升高先升高后降低，在水解温度为55℃时达到最大值28.6%。水解温度升高，加快蛋白质和脂肪的分离速度，但是过高的温度会加快鱼油的氧化。且水解温度超过55℃后，蛋白质凝固变性，将鱼油包裹，鱼油析出量减少，提油率降低[10]。

2.1.1.5 盐析量对提油率的影响

在料液比1∶3、pH 8、水解温度55℃、水解时间30 min、盐析时间15 min条件下，研究盐析量对提油率的影响，结果见图5。

图5 盐析量对提油率的影响

粗鱼油中含有较多杂质，加盐盐析的作用是破坏鱼油形成的乳胶体，使鱼油澄清。从图5可以看出，盐析量加大，使得蛋白质盐析沉淀，包裹鱼油[10]。当盐析量超过3%后，进一步提高盐析量，皂化物之前形成的胶体会发生解析从而使乳化更加严重，提油率下降[11]。

2.1.1.6 盐析时间对提油率的影响

在料液比1∶3、pH 8、水解温度55℃、水解时间30 min、盐析量3%条件下，研究盐析时间对提油率的影响，结果见图6。

图6 盐析时间对提油率的影响

从图6可以看出，一定的盐析时间有助于鱼油从乳状液中分离出来,盐析时间为20 min时，提油率最高；当盐析时间过长时,鱼油容易发生分解,使提油率下降[12]。

2.1.2 正交试验

在单因素试验基础上，以料液比(A)、pH(B)、水解时间(C)、盐析量(D)、盐析时间(E)、水解温度(F)为因素，提油率为指标设计正交试验。稀碱水解法提取罗非鱼鱼油正交试验因素水平见表1，正交试验设计及结果见表2。

表1 稀碱水解法提取罗非鱼鱼油正交试验因素水平

表2 稀碱水解法提取罗非鱼鱼油正交试验设计及结果

由表2可知，影响提油率的主次因素为 Bgt;Egt;Fgt;Agt;Dgt;C。罗非鱼鱼油的最佳提取方案为A3B1C3D2E2F3，即料液比1∶3、pH 7.5、水解时间30 min、盐析量2.5%、盐析时间25 min、水解温度65℃。各因素R值均大于空列的R值，故各因素水平效应的差异是存在的。在最佳试验条件下，进行2次平行验证试验，提油率为(32.13±0.07)%。

2.2 酶解法提取罗非鱼鱼油

2.2.1 单因素试验

2.2.1.1 料液比对提油率的影响

在加酶量0.2%、pH 8、酶解温度60℃、酶解时间3 h的条件下，研究料液比对提油率的影响，结果见图7。

图7 料液比对提油率的影响

从图7可以看出，随着料液比增加，提油率先增大后降低，料液比为1∶3时，提油率最高。料液比较低时，酶与底物接触机会相对较少，反应不完全，提油率较低。当料液比超过一定量时，底物浓度较高，酶与底物不能均匀接触，酶解效果相对较差[13-14]。

2.2.1.2 加酶量对提油率的影响

在料液比1∶3、pH 8、酶解温度60℃、酶解时间3 h的条件下，研究加酶量对提油率的影响，结果见图8。

图8 加酶量对提油率的影响

从图8可以看出，随着加酶量的增加，提油率先升高后下降，加酶量为1%时，提油率最高。当加酶量过低时，不能将蛋白质充分酶解，未完全破坏蛋白质和脂肪的结合关系，鱼油不能被充分释放出来[13]。反之，当加酶量过多时，会抑制酶解反应速率，从而使得提油率降低。

2.2.1.3 pH对提油率的影响

在料液比1∶3、加酶量0.2%、酶解温度60℃、酶解时间3 h的条件下，研究pH对提油率的影响，结果见图9。

图9 pH对提油率的影响

每一种酶都有其最适pH范围，超过这一范围，都不能充分体现酶的活性，甚至会造成酶的不可逆性失活，还会影响酶反应动力学参数[15]。从图9可以看出，在pH 8时，提油率最高。在pH 8条件下，酶活最强，酶分子与底物蛋白质分子快速结合，从而较好地破坏蛋白质和脂肪的结合，使鱼油释放出来。

2.2.1.4 酶解时间对提油率的影响

在料液比1∶3、加酶量0.2%、pH 8、酶解温度60℃的条件下，研究酶解时间对提油率的影响，结果见图10。

图10 酶解时间对提油率的影响

从图10可以看出，酶解反应前2 h内，提油率增大较明显。当酶解时间超过2 h，提油率趋于平缓。这主要是由于随着酶解时间延长，酶与底物反应较完全，破坏脂肪和蛋白质的结合，释放出脂肪分子[15]。但随着酶解时间延长，提油率逐渐趋于平缓。从工作效率、节约能源等角度考虑，酶解时间2 h 较为合适。

2.2.1.5 酶解温度对提油率的影响

在料液比1∶3、加酶量0.2%、pH 8、酶解时间3 h 的条件下，研究酶解温度对提油率的影响，结果见图11。

图11 酶解温度对提油率的影响

酶属于生物大分子，酶解温度过高或过低，都会抑制酶的活性，只有在最适温度下，酶活最强[16]。从图11可以看出，随着酶解温度的升高，提油率先增大后减小，在酶解温度为60℃时，提油率最高。这是因为酶解温度的升高有助于提高酶解体系内分子的热运动，从而使得酶可以更快更好地与底物结合[17]。当酶解温度超过60℃时，温度过高，影响了酶的稳定性，酶解效果变差。

2.2.2 正交试验

在单因素试验基础上，以料液比(A)、加酶量(B)、pH(C)、酶解温度(D)、酶解时间(E)为因素，提油率为指标设计正交试验。酶解法提取罗非鱼鱼油正交试验因素水平见表3，正交试验设计及结果见表4。

表3 酶解法提取罗非鱼鱼油正交试验因素水平

表4 酶解法提取罗非鱼鱼油正交试验设计及结果

续表4

试验号ABCDE空列提油率/%1011332222．621112113324．511213221125．741321231320．251422312126．731523123215．731631323117．641732131220．821833212318．06k124．1522．0021．0924．1123．1521．21k220．6921．7620．9720．9921．9222．20k319．5020．5822．2719．2319．2720．93R04．6501．4201．3004．8803．8801．27

由表4可知，影响提油率的主次因素顺序为Dgt;Agt;Egt;Bgt;C。罗非鱼鱼油的最佳提取方案为A1B1C3D1E1，即料液比1∶3、加酶量0.6%、pH 9、酶解温度55℃、酶解时间2 h。各因素的R值均大于空列的R值，故各因素水平效应的差异是存在的。在最佳试验条件下，进行2次平行验证试验，提油率为(28.91±0.18)%。

2.3 两种方法提取的罗非鱼鱼油脂肪酸组成(见表5)

表5 两种方法提取的罗非鱼鱼油脂肪酸组成及含量 %

注：“-”表示未检出。

由表5可知,稀碱水解法提取的罗非鱼鱼油中饱和脂肪酸含量为(31.610±4.740)%，单不饱和脂肪酸含量为(39.899±4.356)%，n-3多不饱和脂肪酸含量为(5.192±0.280)%，而DHA与EPA总含量为2.225%；酶解法提取的罗非鱼鱼油中饱和脂肪酸含量为(34.396±0.592)%，单不饱和脂肪酸含量为(37.456±0.160)%，n-3多不饱和脂肪酸含量为(4.991±0.099)%，其中DHA与EPA总含量为2.135%。结果表明两种提取方法对罗非鱼鱼油脂肪酸的组成和含量略有影响，但饱和脂肪酸都以棕榈酸为主，不饱和脂肪酸都以油酸和亚油酸为主，DHA和EPA的含量几近相同。王倩倩等[15]通过GC-MS对罗非鱼内脏鱼油的脂肪酸组成进行研究，结果表明主要脂肪酸为棕榈酸、油酸、亚油酸，与本试验分析结果一致，但含量略有差异，这可能是由于罗非鱼体内的脂肪随产地和季节而变化，而且本试验研究的是罗非鱼整鱼的脂肪酸，王倩倩等[15]研究的是内脏脂肪，这也是脂肪酸含量不一致的原因之一。

3 结 论

本试验以冻干罗非鱼粉为原料，采用干重法计算提油率，相比湿重法，具更广泛的应用性。通过单因素试验和正交试验，优化了稀碱水解法和酶解法提取罗非鱼鱼油的最佳工艺条件。得到稀碱水解法提取罗非鱼鱼油的最佳工艺条件为料液比1∶3、pH 7.5、水解时间30 min、盐析量2.5%、盐析时间25 min、水解温度65℃，在此条件下提油率为(32.13±0.07)%；酶解法提取罗非鱼鱼油最佳工艺条件为料液比1∶3、加酶量0.6%、pH 9、酶解温度55℃、酶解时间2 h，在此条件下提油率为(28.91±0.18)%。稀碱水解法的提油率略高于酶解法的。

稀碱水解法提取的罗非鱼鱼油n-3多不饱和脂肪酸含量为(5.192±0.280)%，略高于酶解法的(4.991±0.099)%。说明稀碱水解法提取的鱼油营养价值较酶解法略好。

综上所述，稀碱水解法相较于酶解法，更适合罗非鱼鱼油的提取。

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Extractionoffishoilfromtilapiabyhydrationmethodandfattyacidcompositionanalysis

LI Xue, CAO Jun, BAI Xinpeng， JIANG Zefang, LIU Shaojie, LI Ning
(Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Food Development，College of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，China)

Fish oil was extracted by enzymatic hydrolysis method and diluted alkaline hydrolysis method respectively using tilapia as raw material. The optimal extraction processes of the two hydration methods were determined by single factor experiment and orthogonal experiment. Fatty acid compositions of fish oils were analyzed by GC. The results showed that the optimal extraction conditions of fish oil by diluted alkaline hydrolysis method method were obtained as follows: solid-liquid ratio 1∶3, pH 7.5, hydrolysis time 30 min, salt dosage 2.5%, salting out time 25 min, hydrolysis temperature 65℃.The optimal extraction conditions of fish oil by enzymatic hydrolysis method were obtained as follows: solid-liquid ratio 1∶3, enzyme dosage 0.6%, pH 9, enzymatic hydrolysis temperature 55℃, enzymatic hydrolysis time 2 h. Under the optimal conditions, the oil extraction rate andn-3 unsaturated fatty acid content of diluted alkaline hydrolysis method were (32.13±0.07)% and (5.192±0.280)% respectively, higher than those of enzymatic hydrolysis method((28.91±0.18)%, (4.991±0.099)%).

tilapia; fish oil; enzymatic hydrolysis method; diluted alkaline hydrolysis method; fatty acid

2017-03-19；

2017-07-18

海南省高等学校科研项目(Hnky2016ZD-1)；海南大学科研启动基金项目(kyqd1608)

李 雪(1991)，女，硕士研究生，研究方向为营养与功能食品(E-mail)crystal_lixue@126.com。

曹 君，讲师，博士(E-mail)juncaoyd2007@126.com；白新鹏，教授，博士(E-mail)xinpeng2001@126.com。

油脂加工

TS225.2;TQ645.6

A

1003-7969(2017)10-0005-07