注射神经生长因子对兔眼外肌的影响

石 晶 谭小波 杨 洁 郝佳颖 李 娜 杨 光

(承德医学院附属医院眼科,河北 承德 067000)

注射神经生长因子对兔眼外肌的影响

石 晶 谭小波 杨 洁 郝佳颖 李 娜 杨 光

(承德医学院附属医院眼科,河北 承德 067000)

目的观察大白兔眼外肌注射神经生长因子(NGF)对眼外肌的影响。方法将8只大白兔右眼设为观察组，左眼设为对照组，观察组眼上直肌注射10 μg NGF；对照组眼上直肌相同位置注射等量生理盐水。测量眼外肌湿重，计算眼外肌横截面积，HE染色测量肌纤维周径、观察炎症情况，免疫组化染色测定活化卫星细胞。结果观察组上直肌横截面积〔(12.412±1.372)mm2〕显著大于对照组〔(6.738±0.856)mm2，Plt;0.05〕。观察组兔肌纤维周径〔(228.32±16.57)μm〕显著大于对照组〔(129.32±11.16)μm，Plt;0.05〕。观察组大、中、小细胞构成比分别为27.0%、69.6%、3.5%，对照组大、中、小细胞构成比分别为13.4%、63.5%、23.2%，两组比较差异有统计学意义(Plt;0.05)。HE染色：治疗后2 w，两组兔眼外肌均没有炎症细胞浸润和细胞坏死，肌纤维边界清楚、方向一致、排列整齐。免疫组化染色：观察组活化卫星细胞百分率〔(28.78±4.36)%〕显著大于对照组〔(11.87±2.47)%，Plt;0.05〕。结论眼外肌注射NGF能够活化卫星细胞，促进眼外肌肌纤维增生，对眼组织没有明显不良影响。

神经生长因子；眼外肌；卫星细胞；肌分化因子

斜视是眼科常见疾病，特点为视功能损害和眼球位置失调，重建双眼视功能是斜视的治疗目标。部分斜视患者可以通过视觉训练和佩戴眼镜进行治疗，但大部分斜视患者需要手术治疗。手术通过改变眼外肌长度或者改变眼外肌附着位置达到治疗的目的，但部分手术治疗患者需要二次手术或多次手术治疗，具有一定局限性。肉毒杆菌毒素为治疗斜视的药物，具有化学去神经作用，能够减弱眼外肌肌力，有效治疗部分斜视患者，但对于斜视度数大者，需要多次注射肉毒杆菌毒素。近年来研究发现，增加眼外肌肌力的药物具有治疗斜视的作用，注射胰岛素生长因子等动物生长因子能够增加眼外肌的肌力〔1〕，在斜视的治疗中具有一定作用。神经支配因素是斜视发病的重要原因之一，神经支配减弱可引起神经生长因子(EGF)活性降低，斜视的病理学改变可能和NGF活性下降有关〔2～5〕。本研究拟探讨NGF对兔眼外肌的影响。

1 资料与方法

1.1动物 8只成年、清洁、健康新西兰大白兔，购自浙江大学实验动物中心，体重2.2～2.7 kg，均无眼部疾病，无感染和手术区损伤，无其他疾病。

注射用鼠NGF：武汉海特生物制药股份有限公司，规格：20 μg/2 ml/瓶，国药准字S20060051。

1.2建立大白兔实验模型 将8只大白兔麻醉后，选择右眼为观察组，左眼为对照组。观察组眼在上直肌止点后1 mm肌腹处注入10 μg注射用NGF(10 μg NGF用生理盐水稀释为0.1 ml)；对照组眼在上直肌相同位置注射等量生理盐水，术后涂红霉素眼膏。

1.3取材 术后2 w处死大白兔，切开结膜囊，暴露并分离上直肌，剪下上直肌，在松弛状态下称量上直肌湿重，并测量直肌长度，计算上直肌横截面积，上直肌横截面积=上直肌肌肉湿重/(1.056×上直肌长度)。

1.4上直肌肌纤维周径测量及炎症情况 将上直肌标本用多聚甲醛固定，石蜡包埋后切片，进行常规HE染色，光镜下测量肌纤维的周径，大细胞为周径gt;200 μm，中细胞为100 μm≤周径≤200 μm，小细胞为周径lt;100 μm，每个切片测量150个肌纤维。观察上直肌纤维的炎症情况。

1.5活化卫星细胞测定 将石蜡包埋的上直肌组织切成5 μm厚的切片，采用免疫组化法测定肌分化因子的表达情况，免疫组化染色细胞核为棕黄色者为肌分化因子阳性细胞，肌分化因子阳性位于肌纤维肌膜下的细胞为活化的卫星细胞。

1.6统计学方法 采用SPSS20.0软件行t、χ2检验。

2 结 果

2.1两组兔肌肉炎症情况 HE染色结果显示：治疗2 w后，两组兔眼外肌均没有炎症细胞浸润和细胞坏死，肌纤维边界清楚、方向一致、排列整齐。见图1。

2.2两组活化卫星细胞比较 免疫组化染色：观察组活化卫星细胞百分率〔(28.78±4.36)%〕显著大于对照组〔(11.87±2.47)%〕(t=5.264,Plt;0.05)。见图2。

图1 两组兔眼外肌HE染色(×100)

图2 两组兔活化卫星细胞免疫组化染色(×400)

2.3两组兔大中小细胞比例比较 观察组大、中、小细胞构成比〔148个(27.0%)、382个(69.6%)、19个(3.5%)〕与对照组〔分别为82个(13.4%)、389个(63.5%)、142个(23.2%)〕比较差异有统计学意义(χ2=109.780，Plt;0.05)。

2.4两组兔上直肌横截面积与眼外肌湿重比较 观察组上直肌横截面积〔(12.412±1.372)mm2〕显著大于对照组〔(6.738±0.856)mm2〕(Plt;0.05)，两组眼外肌湿重〔观察组(0.149±0.021)g，对照组(0.112±0.023)g〕差异无统计学意义(Pgt;0.05)。

2.5两组兔肌纤维周径比较 观察组兔肌纤维周径〔(228.32±16.57)μm〕显著大于对照组〔(129.32±11.16)μm，Plt;0.05〕。

3 讨 论

眼外肌力量比较小，平时处于最佳工作状态，眼外肌的解剖结构发生微小变化对眼外肌的功能都会造成影响，眼球正常位置和眼平衡的维持靠眼外肌纤维的紧张度和肌张力。骨骼肌收缩的基本单位是肌小节，眼外肌纤维的排列紊乱及损伤可导致眼外肌收缩力差，斜视的发生可能与此有关。眼外肌的生长和分化依赖于运动神经的支配，眼外肌的神经支配和骨骼肌有所不同，有支配强直纤维的多神经和支配颤动纤维的单神经，眼外肌的神经支配和内部的细微结构共同决定了眼外肌的运动〔6〕。眼外肌的形态结构需要神经营养因子的作用，神经营养因子的丢失会引起新陈代谢、生理生化、形态结构等发生变化〔7〕。胰岛素生长因子为肌肉增加剂，在动物实验中发现有增强眼外肌肌力的作用〔8〕。余新平等〔9〕研究发现，对成年兔眼外肌注射胰岛素样生长因子能够增加卫星细胞活化，增加肌纤维周径，增加眼外肌横截面积，显著提高兔眼外肌的收缩能力。

NGF是典型的神经营养因子，在动物体内广泛存在，具有多肽类生物活性，对神经细胞有营养作用，并对神经细胞的生长和凋亡都有影响。NGF在周围和中枢神经系统疾病的治疗中应用广泛〔10，11〕，骨骼肌受神经支配，NGF对去神经支配的骨骼肌修复和再生具有一定效果〔12，13〕。李廷〔14〕研究发现，先天性麻痹性斜视的上斜肌、下斜肌中NGF表达下降；赵军波等〔15〕研究发现，银杏叶注射液联合鼠NGF注射液对外伤性眼外肌麻痹具有良好的治疗效果。眼外肌再生修复最突出的特点为肌纤维横截面积和湿重增加，本研究结果表明注射NGF能够提高大细胞比例，增加肌纤维周径，促进眼外肌纤维增生。卫星细胞是肌纤维再生的基础，激活的卫星细胞能够调节肌分化因子，本研究也表明NGF可以促进眼外肌中卫星细胞活化，促进眼外肌纤维再生。

1Willoughby CL，Ralles S，Christiansen SP，etal.Effects of sequential injections of hepatocyte growth factor and insulin-like growth factor-I on adult rabbit extraocular muscle〔J〕.J AAPOS，2012；16(4)：354-60.

2陈庆真，施明祥，刘盛飞，等.鼠神经生长因子不同给药方式修复周围神经损伤〔J〕.中国组织工程研究，2014；18(33)：5356-60.

3Diao YP，Cui FK，Yan S，etal.Nerve growth factor promotes angiogenesis and skeletal muscle fiber remodeling in a murine model of hindlimb ischemia〔J〕.Chin Med J (Engl)，2016；129(3)：313-9.

4Ettinger K，Nevo Y，Marcinkiewicz C，etal.Nerve growth factor-induced myoprotection in C2C12 muscle cells is mediated by α9β1 integrin via release of PGE2〔J〕.J Basic Clin Physiol Pharmacol，2015；26(4)：411-5.

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6Clark RA，Demer JL.Changes in extraocular muscle volume during ocular duction〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci，2016；57(3)：1106-11.

7Bhambhwani V，Pandey PK，Kadav M，etal.Superior oblique extraocular muscle shape in superior oblique palsy〔J〕.Am J Ophthalmol，2015；160(4)：846-7.

8Willoughby CL，Christiansen SP，Mustari MJ，etal.Effects of the sustained release of IGF-1 on extraocular muscle of the infant non-human primate：adaptations at the effector organ level〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci，2012；53(1)：68-75.

9余新平，许金玲，陈 洁，等.胰岛素样生长因子局部注射对眼外肌作用的实验研究〔J〕.中国实用眼科杂志，2010；28(8)：923-5.

10官常荣，朱英标，丁 莉，等.鼠神经生长因子联合α-硫辛酸治疗糖尿病周围神经病变的临床观察〔J〕.中国临床药理学杂志，2014；17(10)：892-4，900.

11Wong H，Dong XD，Cairns BE.Nerve growth factor alters the sensitivity of rat masseter muscle mechanoreceptors to NMDA receptor activation〔J〕.J Neurophysiol，2014；112(9)：2275-82.

12Hoheisel U，Reuter R，de Freitas MF，etal.Injection of nerve growth factor into a low back muscle induces long-lasting latent hypersensitivity in rat dorsal horn neurons〔J〕.Pain，2013；154(10)：1953-60.

13Morcuende S，Muoz-Hernández R，Benítez-Temio B，etal.Neuroprotective effects of NGF，BDNF，NT-3 and GDNF on axotomized extraocular motoneurons in neonatal rats〔J〕.Neuroscience，2013；250：31-48.

14李 廷.NGF和CNTF在先天性麻痹性斜视中的表达及其作用机制〔D〕.青岛：青岛大学，2009.

15赵军波，王 斌.鼠神经生长因子注射液肌注联合银杏叶注射液静滴治疗外伤性眼外肌麻痹〔J〕.山东医药，2014；54(27)：103-4.

〔2016-11-19修回〕

(编辑 徐 杰)

R79

A

1005-9202(2017)22-5543-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.024

河北省自然科学基金面上项目 (361008);承德市科技局项目 (201121058)

谭小波(1979-)，男，博士，副主任医师，主要从事眼表疾病研究。

石 晶(1976-)，女，硕士，副主任医师，主要从事儿童眼病，斜弱视及眼屈光方面的研究。