辛伐他汀对快速起搏早期家兔心房肌超微结构的影响及可能机制

王联发 陈 晨 王星星

(中国人民解放军第105医院心内二科，安徽 合肥 230031)

辛伐他汀对快速起搏早期家兔心房肌超微结构的影响及可能机制

王联发 陈 晨 王星星

(中国人民解放军第105医院心内二科，安徽 合肥 230031)

目的建立家兔快速心房起搏模型，探讨辛伐他汀对快速心房起搏早期心房超微结构及L型钙通道α1c蛋白的影响。方法30只家兔随机分为对照组、心房快速起搏组、辛伐他汀组各10只。辛伐他汀组5 mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃2 w，其余组以等量生理盐水灌胃，对照组不行起搏，心房快速起搏组和辛伐他汀组行快速心房起搏(800次/min)建立家兔快速起搏模型，急性起搏8 h后取右房组织，电镜观察心房肌超微结构的改变，免疫组化法观察急性起搏8 h后右房组织L型钙通道α1c蛋白表达。结果心房快速起搏组起搏8 h后心房肌细胞超微结构有明显变化，如肌原纤维排列紊乱、肌小节减少，肌溶解、线粒体肿胀、空泡样改变、糖原聚集等心房结构重构的改变，心房肌细胞L型钙通道的α1c亚单位的蛋白表达水平较对照组明显下降。辛伐他汀组心房肌超微结构的改变相对较轻，L型钙通道α1c亚单位的蛋白表达水平较对照组下降不明显。结论辛伐他汀可明显改善快速起搏早期家兔心房肌超微结构的变化，对快速心房起搏导致的L型钙通道α1c亚单位的表达有一定保护作用。

辛伐他汀；快速起搏；心房重构；L型钙离子通道

心房颤动(AF)是临床最为常见、复杂的心律失常之一，随年龄增加发病率逐步升高〔1〕。周自强等〔2〕调查表明，我国AF的患病率为0.77%，80岁以上人群AF患病率达7.5%。AF转复后药物维持窦性心律的只有65%，3年的维持率只有20%〔3〕。AF的发生及维持机制日益引起关注。AF可使心房发生电重构及结构重构，而心房重构发生的同时也加重AF的发生及维持。本文通过建立快速家兔起搏模型，观察快速起搏早期心房肌超微结构的改变及辛伐他汀预处理对其影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 新西兰大耳白家兔30只，购自安徽医科大学实验动物中心，体重2.0～2.5 kg，雌雄不拘。30只家兔均分为对照组、心房快速起搏组、辛伐他汀组。辛伐他汀组5 mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃2 w，其余组以等量生理盐水灌胃2 w。

1.2主要试剂、溶液成分 ①辛伐他汀片 (杭州默沙东制药有限公司)；②山羊抗兔抗体 (美国Chemicon公司)；③液体石蜡、二甲苯、各浓度乙醇溶液、苏木素、伊红染液 (解放军第105医院病理实验室提供)；④SP-900免疫组化染色试剂盒 (北京中杉金桥生物技术有限公司)；⑤3%戊巴比妥钠溶液：戊巴比妥钠3 g溶解100 ml无菌生理盐水，常温保存。⑥3%戊二醛溶液：30%戊二醛10 ml加入0.1 mmol/L二甲砷酸钠缓液，定容至100 ml，避光保存于4℃冰箱。⑦10%甲醛：量取市售甲醛100 ml，加Na2HPO44 g、NaH2PO46.5 g及焦碳酸二乙酯(DEPC)水至1 000 ml，常温保存备用。⑧二氨基联苯胺(DAB)显色剂：取1 ml超纯水，加入1滴试剂盒中A试剂，充分混匀在分别滴加B、C试剂各1滴，再次混匀，现配现用，配后避光保存。

1.3快速心房起搏模型的建立 各组家兔分别给予3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)经耳缘静脉注射麻醉，静脉推注肝素1 000 U，将兔仰卧固定于兔台，颈部正中切口，分离右侧颈内静脉并切开，近头端结扎，置入1根5F四极电极导管(电极间距5 mm)至右房，插入深度约6 cm，将远端电极对与心电图左、右上肢电极相连，记录家兔右心耳内膜心电图，示大A小V，表明电极位于右心房，固定好电极导管。心房快速起搏组和辛伐他汀组采用心脏电生理刺激仪连续单刺激模式进行8 h的快速心房起搏，起搏频率为800次/min，电压4 V，对照组植入起搏电极，但不行高位快速右房起搏刺激，定时观察家兔的反应状态。

1.4标本的采集 根据实验分组，分别在起搏8 h结束后，采用空气栓塞法快速处死家兔，无菌技术开胸，迅速取出心脏，在磷酸盐缓冲液(PBS)中漂洗心脏，剪下右心房组织，用双面刀片修成约1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，一部分于2.5%戊二醛4℃保存固定准备行电镜观察，一部分于10%甲醛中固定准备行HE染色及免疫组化试验。

1.5电镜观察 梯度脱水后环氧树脂包埋，制成超薄组织切片。醋酸双氧铀溶液和柠檬酸铅溶液染色(铅、铀双染色)，在JEM10OCX1I透射电镜下，60～80 kV加速电压，10 000～20 000放大倍率，观察左房心肌细胞超微结构变化，选取典型视野拍照。

1.6HE染色 右心房组织存10%甲醛中固定24 h后，脱水、常规石蜡包埋、切片，行HE染色，观察细胞形态的完整性。

1.7免疫组化染色 固定好的家兔右心房心肌组织按HE染色方法脱水、包埋、切片，常规脱蜡脱水，灭活内源性过氧化物酶，滴加试剂A，37℃孵育30 min，滴加按适当比例稀释的一抗，4℃孵育过夜后置于37℃恒温箱平衡40 min，PBS洗涤3 min×5次；滴加试剂B，37℃孵育30 min，PBS洗涤3 min×5次；滴加试剂C，37℃孵育30 min，PBS洗涤3 min×5次；DAB显色，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。应用计算机辅助图像分析系统进行分析，每组高倍镜(放大400倍)下随机选择8个视野，计算每个视野L型钙离子通道α1c亚单位蛋白表达平均光密度值，作为蛋白表达量。

1.8统计学方法 应用SPSS15.0统计软件进行单因素方差分析及t检验。

2 结 果

2.1一般情况 实验过程中，心房快速起搏组1只家兔在建模过程中死亡，解剖后考虑为心脏破裂导致大出血，又补充1只家兔，共有30只家兔建模成功，顺利完成实验。见图1、图2。

图1 快速起搏前正常家兔心电图(纸速 50 mm/s，Ⅱ导联)

图2 快速右心房起搏家兔心电图(纸速 50 mm/s，Ⅱ导联)

2.2各组心肌组织电镜观察 对照组心房组织在电镜下见心肌纤维排列规则，无断裂、溶解，肌小节明暗带清楚，线粒体形态较规则。心房快速起搏组心肌纤维排列明显紊乱，心肌纤维出现不同程度的损伤，包括肌纤维肿胀、断裂、溶解；肌小节明暗带不可区分；肌丝明显减少；糖原聚集；线粒体肿胀、体积变大，部分破裂，数量减少，有的出现空泡样改变。辛伐他汀组上述改变出现逆转，明暗带恢复，肌细胞排列比较整齐，但部分线粒体仍有异常，见图3。

图3 各组心肌组织电镜观察

2.3免疫组化观察L型钙离子通道α1c亚单位阳性表达情况 HE染色可见心房肌细胞排列规则，细胞大小匀齐。L型钙离子通道α1c亚单位免疫组化阳性表达为棕褐色的细颗粒状，主要分布在细胞膜和细胞质，纵切视野阳性颗粒沿细胞膜分布，横切视野胞质阳性颗粒呈点状散在，见图4。对照组细胞膜和细胞质均有着色，分布较均匀，平均光密度0.245±0.014，心房快速起搏组阳性表达呈散在分布，较对照组明显减少(0.133±0.007,Plt;0.05)，辛伐他汀组阳性表达较心房起搏组有改善(0.199±0.011，Plt;0.05)，说明辛伐他汀对快速心房起搏导致的L型钙通道α1c亚单位的表达有一定保护作用。

图4 心肌组织α1c亚单位免疫组化表达(SAB,×400)

3 讨 论

AF的心房结构重构主要体现在心房组织、细胞、分子水平的心房大体结构和超微结构的病理改变，表现为细胞肥大、细胞内糖原累积、细胞超微结构的改变、内膜纤维化及脂肪组织浸润等，并且与心房电重构密切相关，心房结构重构可致心房电传导及兴奋性异常，为AF的发生与维持提供了重要的病理基础〔4〕。有研究发现〔5，6〕，当心房电重构被逆转至正常后，AF的持续原因和结构重构若仍然存在，则仍较容易引发AF，提示心肌细胞的结构重构在AF维持和发展中起重要作用。一旦AF发生，它将引起心房电重构及结构重构，心房重构又为AF的维持提供了结构基础，两者互为因果，最终发展为永久性AF，形成“AF诱发AF”的恶性循环〔7～9〕。研究认为钙超载在心房重构中起重要作用，在AF早期快速激动引起大量的钙离子进入细胞内，造成钙离子超载，导致线粒体等细胞器代谢异常及蛋白水解酶活性改变，产生肌小节缺失、肌溶解〔10〕；同时钙超载导致的钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaMK)Ⅱ磷酸化还能够激活组蛋白去乙酰化酶(HDAC)下游效应器的重构，引起心房收缩功能异常〔11〕。其中L型钙离子通道是决定心肌细胞内Ca2+含量和肌质网Ca2+释放的主要通道〔12〕，L型钙离子通道是一个由多种不同亚型构成的离子通道家族，而α1亚基为各种亚型钙离子通道的核心组成部分，由其构成离子通道结构，并决定通道的电生理特性。本研究可见快速起搏家兔心房8 h即可出现心房肌组织重构，L型钙离子通道α1c亚单位阳性表达明显下调，与心房组织超微结构的变化相对应，因此推测α1c亚单位的表达改变可能是AF心房肌组织重构的分子基础之一。辛伐他汀为羟甲基戊二酸单酰辅酶(HMG-Co)A还原酶抑制剂，广泛应用于临床，多用于阻滞胆固醇的合成、治疗高脂血症，近年来的研究发现，他汀类药物具有除治疗高脂血症之外的其他方面的作用，并不依赖于降血脂功能，称之为他汀的多效性〔13〕。2010年欧洲心脏病协会(ESC)AF指南〔14〕指出，通过动物实验证实他汀类药物具有较好的抗心律失常的作用，推荐作为AF一级预防和二级预防(上游治疗)的重要药物。Rader等〔15〕对200 例CABG 术后患者进行研究(其中50例在术后48 h内给予他汀类药物)，结果显示预防性给予他汀类药物可以减少术后AF的发生和缩短患者的住院时间。

本研究提示辛伐他汀具有调节快速起搏家兔心房L型钙通道α1c亚单位变化的作用，这可能为其抗心律失常的细胞学离子机制之一。

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〔2016-03-27修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

R541.7

A

1005-9202(2017)22-5518-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.014

南京军区联勤部资助课题(No.11YG04)

王联发(1967-)，男，主任医师，硕士生导师,主要从事心脏起搏与心电生理研究。