IDO/TTS介导的色氨酸代谢途径在免疫性血小板减少症患者发病及治疗中的作用

应伊丽　袁远

[摘要] 目的 探讨IDO/TTS介导的色氨酸代谢途径在免疫性血小板减少症患者的发病和治疗中的作用。 方法 选取2015年7月～2017年8月我院收治的36例免疫性血小板减少症患者和36例来我院体检的健康人为研究对象，分别为观察组和对照组，观察组给予地塞米松40 mg/d进行治疗，对照组不采取任何处理。通过液相-质谱分析仪检测血浆中犬尿氨酸（Kyn）和色氨酸（Trp）的浓度；通过流式细胞仪检测T淋巴细胞中IDO和TTS的表达。 结果 与对照组相比，治疗前免疫性血小板减少症患者血浆中Kyn、Trp、Kyn/Trp的表达量较高，IDO的表达量较低，而TTS的表达量则明显较高，差异有统计学意义（P<0.05）；观察组经有效治疗后，患者血浆中Trp的浓度降低，而Kyn浓度及Kyn/Trp比值则明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；患者IDO表达量明显上升，而TTS的表达量则明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 地塞米松对免疫性血小板减少症患者疗效显著，主要通过IDO/TTS介导的色氨酸代谢途径发挥作用，临床可以通过监测IDO、TTS的水平指导其治疗。

[关键词] IDO；TTS；免疫性血小板减少症；发病；治疗

[中图分类号] R593.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）36-0006-04

[Abstract] Objective To investigate the role of IDO/TTS-mediated tryptophan metabolic pathway in the pathogenesis and treatment of patients with immune thrombocytopenia. Methods A total of 36 patients with immune thrombocytopenia admitted in our hospital from July 2015 to August 2016 and 36 healthy volunteers who were in our hospital for physical examination were divided into observation group and control group. The observation group was given dexamethasone 40 mg/d. The control group was not given any treatment. Plasma concentrations of Kyn and Tryptophan were measured by liquid chromatography-mass spectrometry. The expression of IDO and TTS in T lymphocytes was detected by flow cytometry. Results Compared with that of the control group， the Kyn， Trp and Kyn/Trp plasma level in patients with pre-immune thrombocytopenia was higher， and the expression of IDO was lower， and the expression of TTS was significantly higher， and the difference was significant（P<0.05）. After effective treatment， the concentration of Trp in the plasma of the observation group was decreased， while the Kyn concentration and Kyn/Trp ratio of the observation group was significantly increased， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The IDO expression level significantly increased， while the expression of TTS was significantly decreased， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion Dexamethasone has a significant effect on patients with immune thrombocytopenia. It plays a role mainly through the tryptophan metabolic pathway mediated by IDO/TTS. Dexamethasone can monitor the level of IDO and TTS in order to guide its treatment. Clinically， IDO and TTS levels can be monitored to guide the treatment.

[Key words] IDO； TTS； Immune thrombocytopenia； Incidence； Treatment

免疫性血小板減少症（primary immune thrombocytopenia，ITP）又称特发性血小板减少性紫癜，属于获得性自身免疫性疾病[1，2]，是由于自身反应性B和T细胞被自身血小板抗原所激活[3]，而发生免疫介导的单核巨噬细胞系统过度破坏被自身抗体致敏的血小板或免疫介导的巨核细胞抑制血小板的释放，导致患者产生血小板减少或破坏的免疫性疾病[2，4]，主要表现为血小板减少、皮肤黏膜出血、乏力等症状[5]。地塞米松属于肾上腺糖皮质激素，具有抗炎、抗过敏、抗病毒的多种功效，主要用于治疗严重过敏[6]、哮喘、皮肤病和慢性阻塞性肺部疾病[7]、结核病[8]、免疫性疾病[9，10]，作为治疗免疫性血小板减少症的首选药物，其临床有效率可达70%[11]。色氨酸（Trp）是细胞生存和周期进展中的必须氨基酸，T细胞的周期进程对细胞内Trp含量很敏感，当Trp浓度降低时，T细胞周期发生阻滞，T细胞的增殖会发生抑制[12]。Trp主要沿犬尿氨酸（Kyn）途径进行分解，吲哚胺2，3-双加氧酶（indolea-mine2，3-dioxygenase，IDO）是Trp沿上述途径分解的限速酶和关键酶。Trp-tRNA合成酶（Tryptophanyl- tRNAsynthetase，TTS）属于胞内酶，可以将Trp加载到其自身特异的tRNA上，形成Trp-tRNA的复合物，降低了IDO对Trp的消耗，拮抗其对T细胞增殖的抑制[13]。本研究选择2015年7月～2017年8月我院收治的36例免疫性血小板减少症患者和来我院体检的36例健康人为研究对象，探讨IDO/ TTS介导的色氨酸代谢途径在免疫性血小板减少症患者的发病和治疗中的作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 入选标准

符合1994年全国第五届血栓与止血学术会议中提出的《ITF诊断标准》：（1）实验室检测结果显示血小板减少；（2）脾脏轻度或不肿大；（3）脊髓检查结果显示巨核细胞成熟障碍，数目正常或增多；（4）至少满足以下中的一项：①血小板相关免疫球蛋白（PAIg）数目增加；②血小板相关补体3（PAC3）数目增加；③脾切除治疗有效；④激素治疗有效；⑤血小板寿命减少。

1.2 排除标准

（1）有其他自身免疫性疾病患者；（2）有严重高血压、糖尿病患者；（3）有消化道溃疡、肝炎、慢性阻塞性肺疾病等慢性感染性疾病患者；（4）采样前1个月内使用过免疫抑制剂或糖皮质激素的患者。

1.3 一般资料

选择2015年7月～2017年8月我院收治的36例免疫性血小板减少症患者和36例来我院体检的健康人为研究对象，分别为观察组和对照组。观察组男20例，女16例；年龄12～69岁，平均（34.72±6.48）岁；血小板计数为（1～58）×109/L，平均血小板计数为（16.82±9.31）×109/L，均符合以上入选标准。对照组均为来我院体检的健康人，其中男19例，女17例；年龄24～62岁，平均（35.61±3.79）岁；血小板计数为（143～289）×109/L，平均血小板计数为（207.84±40.12）×109/L。两组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.4 治疗方法

观察组给予地塞米松（遂成药业股份有限公司，H41021038）进行治疗，剂量为40 mg/d，持续给药4 d的方案进行治疗。对照组不做任何治疗性处理。在治疗前和治疗后第5 d抽取两组患者肝素抗凝血样本。

1.5 检测方法

1.5.1 分离血浆和外周单个核细胞 分别取观察组患者治疗前、治疗后5 d及正常对照组经肝素抗凝处理后的外周血10 mL，于1000 rpm下离心10 min，将上层富含血小板的血浆吸出置于另外一支离心管中，于3000 rpm下离心5 min，吸取上层血浆保存于-80℃。将下层的细胞层用PBS稀释。将分离液和稀释液按2∶1的比例配置淋巴细胞分离液，将血液缓慢轻柔地加入到淋巴细胞分离液中，于800 rpm下离心25 min，吸取中间白膜层，于4℃、600 rpm下离心10 min，弃上清，取下层细胞层，用PBS洗涤，再次于4℃、1000 rpm下离心10 min，弃上清，下层即为外周单个核细胞（PBMCs），用PBS重悬PBMCs，调整细胞浓度。

1.5.2 液相-质谱联用分析检测血浆中Kyn、Trp浓度 在上述各组100 μL的血浆样本中加入10 μL的乙腈，涡旋1 min，于14 000 rpm下离心30 min后取上清液进行液相-质谱分析。流动相A相：水与乙腈体积比（V/V）为95∶5，其中甲酸含量为0.1%；流动相B相：水与乙腈体积比（V/V）为5∶95，其中甲酸含量为0.1%。以0.2 mL/min的速度进行梯度洗脱。采用外标法进行测定。

1.5.3 流式细胞仪检测T淋巴细胞CD4+和CD8+中IDO和TTS的表达 用PBS调整PBMCs浓度为5×105/L，每管加 5 mL CD4+和CD8+抗体，于4℃下孵育30 min，PBS洗涤，加入500 mL 固定液进行固定，PBS洗涤后，将细胞用破壁液进行重悬，于1800 rpm下离心20 min，弃上清。分别加入一抗、二抗进行孵育，加入PBS离心洗涤、重悬，将处理好的样品放入流式细胞仪进行检测。

1.6 疗效判定标准

（1）完全缓解：临床症状消失，无出血，血小板数≥100×109/L。（2）有效：临床症状缓解，无出血，血小板数≥30×109/L且较治疗前增加2倍以上。（3）无效：满足以下之一：①临床症状未得到明显缓解，仍然有出血的症状；②血小板数<30×109/L；③血小板数增加未达治疗前2倍。符合（1）或（2）的为临床有效病例，符合（3）的为临床无效病例。临床有效率=（完全缓解例数+有效例数）/总病例数×100%。

1.7统计学方法

应用SPSS18.0统计软件对数据进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 地塞米松疗效结果

36例免疫性血小板减少症患者经大剂量地塞米松治疗后，完全缓解12例，有效18例，无效6例，临床有效率为83.33%。80.00%以上的患者临床症状得到缓解，且无明显的不良反应。

2.2不同组患者血浆中Kyn、Trp的水平及Kyn/Trp比值比较

与对照组相比，治疗前免疫性血小板减少症患者血浆中Kyn、Trp、Kyn/Trp的表达量较高，差异有统计学意义（P<0.05）；与治疗前相比，观察组有效治疗组中，患者血浆中Trp的浓度降低，而Kyn浓度及Kyn/Trp比值则明显升高，差异有统計学意义（P<0.05）；与治疗前相比，观察组无效治疗组中，患者血浆中Kyn、Trp水平以及Kyn/Trp比值均无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.3不同组患者T淋巴细胞CD4+和CD8+中IDO和TTS表达结果比较

与对照组相比，观察组治疗前免疫性血小板减少症患者CD4+和CD8+T淋巴细胞中IDO的表达量较低，而CD4+和CD8+T淋巴细胞中TTS的表达量则明显较高，差异有统计学意义（P<0.05）；与治疗前相比，观察组有效治疗组中，患者CD4+和CD8+T淋巴细胞中IDO表达量明显上升，而CD4+和CD8+T淋巴细胞中TTS的表达量则明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）。在观察组无效组中，患者治疗前后血CD4+和CD8+T淋巴细胞中IDO、TTS的水平无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

3 讨论

免疫性血小板减少症（ITP）是一种由淋巴细胞介导的自身免疫性疾病，主要临床表现为出血，是临床上最常见的出血性疾病之一[14，15]。自身免疫性血小板清除的增加、血小板的破坏、血小板生成的减少等打破了正常人体血小板生成与清除间的平衡，而导致患者体内血小板数量减少。早期研究者们认为ITP的发病主要是由于患者体内体液免疫的异常所致，但由于部分患者体内未检测到特异性血小板抗体，如今，研究者们更倾向于认为ITP的发病主要是由于患者体内细胞免疫的异常所致[16]，CD4+T淋巴细胞是调节免疫系统的关键细胞，是启动和维持自身抗血小板抗体活性的关键，在免疫性血小板减少症的发病中发挥重要作用[17]。

糖皮质激素是临床用于治疗自身免疫性疾病的首选药物[18]，其中地塞米松是公认的治疗免疫性血小板减少症的首选药，一直备受关注。地塞米松用于治疗ITP具有疗效显著、见效快、毒副作用少等优点，其主要通过抑制T淋巴细胞的激活，进而抑制自身免疫反应的发生；降低毛细血管的通透性；B淋巴细胞的分化以及抑制患者体内对抗原的吞噬和处理而发挥其治疗作用。但长期大剂量使用地塞米松其毒副作用也会出现。相比于正常人，免疫性血小板減少症患者体内IDO和TTS表达均不同[19]，经地塞米松治疗后，患者体内IDO/TTS代谢的改变值得我们深入研究。

在本研究中，我们选取了2015年7月～2017年8月我院收治的36例免疫性血小板减少症患者和36例来我院体检的健康人为研究对象，分为观察组和对照组，研究组给予地塞米松40 mg/d进行治疗，疗程为4 d，对照组不采取任何处理，治疗前和治疗后一周采集经肝素抗凝的样本血。通过液相-质谱分析仪检测血浆中犬尿氨酸（Kyn）和色氨酸 （Trp）的浓度，比较治疗前观察组和对照组以及观察组治疗前后Kyn和Trp表达的不同，分析IDO的活性；通过流式细胞仪检测T淋巴细胞中IDO和TTS的表达，比较治疗前观察组和对照组以及观察组治疗前后IDO和TTS表达的不同。结果显示：与对照组相比，治疗前免疫性血小板减少症患者血浆中Kyn、Trp、Kyn/Trp的表达量较高，差异有统计学意义（P<0.05）；与治疗前相比，观察组经有效治疗后，患者血浆中Trp的浓度降低，而Kyn浓度及Kyn/Trp比值则明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组相比，治疗前免疫性血小板减少症患者T淋巴细胞中IDO的表达量较低，而TTS的表达量则明显较高，差异有统计学意义（P<0.05）；与治疗前相比，观察组经有效治疗后，患者T淋巴细胞中IDO表达量明显上升，而TTS的表达量则明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）。在无效治疗组中，患者治疗前后血浆Kyn、Trp、Kyn/Trp、IDO、TTS的水平无明显变化。

地塞米松对免疫性血小板减少症患者疗效显著[20]，主要通过IDO/TTS介导的色氨酸代谢途径而发挥作用，临床可以通过监测患者体内IDO、TTS的水平，从而指导免疫性血小板减少症的治疗，为免疫性血小板减少症的临床治疗提供一条新思路。

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（收稿日期：2017-10-31）