蒙古族缺血性脑卒中人群CYP2C19基因多态性的研究

张东威　武燕　徐晓晨　刘跃辉　塔娜

[摘要] 目的 探讨内蒙古通辽市蒙古族缺血性脑卒中人群CYP2C19基因单核苷酸多态性的分布特点。 方法 在2014年8月～2015年5月期间，连续从我院选择蒙古族缺血性脑卒中患者100例，选取同期非缺血性脑卒中患者100例作为对照。收集病史及部分实验室检查结果，抽取静脉血进行DNA的提取，应用聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性分析技术来检测CYP2C19基因的多态位点CYP2C19*2和CYP2C19*3，用卡方检验分析CYP2C19*2与CYP2C19*3基因型和等位基因的分布，应用Logistic回归深入分析CYP2C19基因多态性与缺血性脑卒中的相关性。 结果 在缺血性脑卒中组CYP2C19 681G→A频率53.54%，CYP2C19 636 G→A频率10.31%，在非缺血性脑卒中组CYP2C19 681G→A频率36.00%，CYP2C19 636 G→A频率15.15%。多变量Logistic回归分析发现，CYP2C19 681A基因型与蒙古族缺血性脑卒中相关。 结论 CYP2C19 681A基因型可能是通辽地区蒙古族人群发生缺血性脑卒中的独立危险因素。

[关键词] 蒙古族；CYP2C19；缺血性脑卒中；基因多态性

[中图分类号] R743 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）36-0001-05

[Abstract] Objective To investigate the distribution of CYP2C19 single nucleotide polymorphism in Mongolian ischemic stroke population in Tongliao City of Inner Mongolia. Methods 100 Mongolian patients with ischemic stroke in our hospital from August 2014 to May 2015 were continuously selected. 100 patients with non-ischemic stroke in the same period were selected as the control group. The medical history and some laboratory tests were collected. The venous blood was extracted for DNA extraction. The polymorphisms sites including CYP2C19*2 and CYP2C19*3 were detected by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP） analysis technology. The distribution of CYP2C19*2 and CYP2C19*3 genotypes and alleles was analyzed by chi-square test. The correlation between CYP2C19 gene polymorphisms and ischemic stroke was analyzed by Logistic regression. Results The frequency of CYP2C19 681G→A was 53.54%， the frequency of CYP2C19 636 G→A was 10.31% in ischemic stroke group. The CYP2C19 681G→A frequency was 36.00% and the CYP2C19 636 G→A frequency was 15.15% in non-ischemic stroke group. Multivariate Logistic regression analysis found that CYP2C19 681A genotype was associated with Mongolian ischemic stroke. Conclusion CYP2C19 681A genotype may be an independent risk factor for ischemic stroke in Mongolian population in Tongliao area.

[Key words] Mongolian； CYP2C19； Ischemic stroke； Genetic polymorphism

腦卒中是好发于中老年人群的一组疾病，是成人慢性致残的主要原因[1]。近年来研究表明，脑卒中是导致与年龄相关的认知衰退和痴呆的重要原因[2]。抗血小板聚集方案在缺血性脑卒中治疗中不可或缺，在急性期积极应用拜阿司匹林或氯吡格雷等抗血小板药物可改善其预后。阿司匹林具有较强的刺激性，进入人体后可致胃肠道出血、溃疡等不良反应。氯吡格雷是除阿司匹林外最常用的一种抗血小板聚集药物，然而在实际医疗工作中发现部分口服常规剂量氯吡格雷的患者仍发生与血栓相关的恶性脑血管事件，这一现象人们用“氯吡格雷抵抗”（clopidogrel resistance，CPR）解释。研究发现，参与氯吡格雷代谢的细胞色素P450酶（Cytochrome P450，CYP450）的活性与CPR关系紧密。

CYP450酶由位于10号染色体上q24.1～q24.3位点的CYP2C19基因编码。目前发现该基因存在较高的突变率，随着个体、地域及种族的差异而变化。发生突变的CYP2C19基因不能编码具有正常代谢能力的酶类，进入体内的氯吡格雷不能有效被代谢及发挥疗效。临床试验表明，东亚人群中CYP2C19基因发生突变的比例最高，我国大陆地区汉人群中最主要的突变类型是CYP2C19*2、CYP2C19*3[3，4]。通辽市位于内蒙古东部地区，是蒙古族人最集中、最密集的区域，居住在这里的蒙族人有着悠久的发展历史，有着特殊的游牧生活背景及马背上的文化。关于该地区的CYP2C19基因多态性的研究目前报道较少。本研究探讨历史悠久的蒙古族人群CYP2C19弱代谢基因分布情况，为进一步研究CYP2C19基因多态性与氯吡格雷抵抗的相关性、开展缺血性脑卒中（cerebral ichemic stroke，CIS）个体化治疗及二级预防奠定基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2014年8月～2015年5月期间，顺序从内蒙古民族大学附属医院蒙医脑病科选择缺血性脑卒中患者100例（CIS组）、非缺血性脑卒中患者100例。纳入标准：①缺血性脑卒中的诊断依据第四届全国脑血管病会议修订的诊断标准[5]；②并且经过头颅256排螺旋CT或者核磁共振平扫/弥散加权成像证实[6]；③蒙古族人群要求至少3代均为蒙古族。排除标准：①脑出血、短暂性脑缺血发作、颅内静脉血栓形成、神经变性疾病、中枢神经系统感染、颅内肿瘤、严重的肝肾疾病、血液系统疾病、恶病质、脏器衰竭及其他严重影响代谢的疾病；②患有肝炎、结核等传染病患者；③妊娠期及哺乳期患者。对照组：选择同一时期体检的100例患者作为对照组（N-CIS组），可能伴有高血压、糖尿病、冠心病、吸烟等危险因素的人群，符合上述排除条件。所选研究对象均为无血缘关系且年龄和性别分布无显著性差异的人群。

1.2 方法

1.2.1 临床资料的采集 记录所有符合纳入标准和排除标准的研究对象的个人信息，包括姓名、年龄、性别、个人史、既往史、家族史等。

1.2.2 实验室检查项目 血脂、空腹血糖、尿素、尿酸、血小板计数等实验室指标均由内蒙古民族大学附属医院检验科检测。

1.2.3 基因多态性的检测 采集受试者静脉血2 mL至EDTA抗凝管中，并充分混匀避免凝血或者溶血。立即置于-80℃的条件下保存（不超过3个月），送至北京诺赛基因组研究中心有限公司进行DNA的提取及CYP2C19*2、CYP2C19*3单核苷酸基因多态性的检测。基本操作流程：血液基因组提取→设计合成引物→PCR扩增→优化PCR反应条件→测序→SNP分型。该试验中检测CYP2C19*2、CYP2C19*3的基因序列，設计引物序列如下：CYP2C19*2-F：TTATAGTTTTAAATTACAACCAGAGC、CYP2C19*2-R：TGCTTCTCAAGCATTACTCCTTGA；CYP2C19*3-F：ATCATTTA-GCTTCACCCTGTGATCC、CYP2C19*3-R：TTGGAGTTTAGTGGAAAAAACACTG。然后进行PCR，优化PCR产物，检测PCR产物，CYP2C19*2的长度为350 bp，CYP2C19*3的长度为400 bp。

1.3 统计学方法

采用SPSS19.0软件进行统计学分析。计数资料以率（%）表示，等位基因分布及频率组间比较采用χ2检验。用Hardy-Winberg 平衡检验样本的群体代表性，综合评价各因素与缺血性脑卒中的关系，采用多因素Logistic回归分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蒙古族CIS组与N-CIS组CYP2C19基因型和等位基因分布频率比较

由于多种原因导致在检测CYP2C19*2基因多态性时有1例失败，检测CYP2C19*3基因多态性时有4例失败。在缺血性脑卒中组CYP2C19 681G→A频率53.54%，CYP2C19 636 G→A频率10.31%，在非缺血性脑卒中组CYP2C19 681G→A频率36.00%，CYP2C19 636 G→A频率15.15%。应用卡方检验得出蒙古族缺血性脑卒中组CYP2C19 681A基因型和A等位基因频率显著高于蒙古族非缺血性脑卒中组（表1）。

2.2 CYP2C19基因多态性与缺血性脑卒中的相关性

以缺血性脑卒中作为因变量，高血压病、糖尿病、冠心病、吸烟、高脂血症、CYP2C19 681A作为自变量，应用多变量Logistic回归分析蒙古族缺血性脑卒中组危险因素显示，CYP2C19 681A基因型是蒙古族缺血性脑卒中的独立危险因素（优势比2.523，95%可信区间1.241～5.129，P=0.011），吸烟（P=0.000）、高血压（P=0.000）、冠心病（P=0.035）也与缺血性脑卒中发生相关，而糖尿病（P=0.900）、高脂血症（P=0.628）与蒙古族缺血性脑卒中的发生无关（表2）。

2.3蒙古族CYP2C19基因多态性与其他少数民族比较

将得到的试验数据与先前针对国内其他少数民族CYP2C19基因多态性的研究结果进行比较，如与回族、藏族、白族等民族进行比较，对功能缺陷型等位基因CYP2C19*2和CYP2C19*3与之前的研究结果进行对比分析。结果发现，CYP2C19*2等位基因在蒙古族分布频率（50.8%）明显高于其他少数民族，CYP2C19*2在回族（47.9%）与维吾尔族（42.1%）的分布也较高，在土族的分布频率最低（14.0%）。CYP2C19*3等位基因在撒拉族人群分布频率最高（13.6%），在蒙古族分布频率排第二（13.3%）。综合来看，蒙古族CYP2C19等位基因突变率较高，由于CYP2C19*2、CYP2C19*3均导致编码的酶活性减低，因此，蒙古族人群中可能有较高比例的人群对经CYP2C19代谢酶代谢的药物呈现出弱代谢能力（表3）。

3讨论

脑卒中和冠心病是导致非正常死亡和致残的最常见原因，其中缺血性脑卒中占主要比例[7-16]。缺血性脑卒中的发生与多种因素相关，包括外部因素和内部因素，外部因素如饮食习惯、周围环境等。遗传因素是最重要的内部因素，也是目前研究的热点之一。遗传因素包括代谢通路中一系列的酶、转运蛋白及受体。CYP2C19酶是一类非常重要的肝内药物代谢酶，接近2%的临床用药需经过其代谢发挥药理作用。CYP2C19代谢酶存在于肝脏的微粒体内，由490个氨基酸残基组成。编码CYP2C19代谢酶的基因，包含9个外显子和5个内含子[17]。CYP2C19*2是第5外显子的681G→A发生突变，形成异常剪切位点，使转录时第5外显子的初始段丢失碱基对，改变了mRNA的阅读框架，导致合成蛋白质的过程被提前终止。CYP2C19*3是第4号外显子636G→A发生突变，导致mRNA的阅读框架发生改变，终止密码子提前，产生失去催化活性的蛋白质。这两种突变均使CYP2C19代谢酶的活性减低，其中CYP2C19*2发生变异更常见，是CYP2C19的主要缺陷型等位基因，占CYP2C19所有变异总数的95%左右。

CYP2C19等位基因的分布存在较大的种族和地区差异。有研究[18]通过合并分析36篇文献，包含15个国家来自东亚、东南亚、南亚和西亚的9693例亚洲健康人CYP2C19基因型的信息，发现CYP2C19等位基因发生率在亚洲不同区域和中国不同地域之间均存在较大差异。CYP2C19*1、*2、*3三个等位基因在东亚人群发生频率分别为61.0%、31.2%、7.8%，在东南亚人群发生频率分别为67.6%、28.8%、3.7%，在南亚人群发生频率分别为64.0%、35.2%、0.8%，在西亚人群发生频率分别为87.3%、12.1%、0.6%。有研究[19]报道欧洲白种人CYP2C19*1、*2、*3三个等位基因发生率分别为85.3%、14.8%、0.0%和非洲黑种人CYP2C19三个等位基因发生率分别为82.3%、17.3%、0.4%。在本研究中，蒙古族CYP2C19 弱代谢的发生频率较其他少数民族均较高。

CYP2C19基因突变可能与动脉粥样硬化相关疾病有关，如CYP2C19*2、*3突变基因在发生动脉粥样硬化疾病的患者中更常见[20-23]。相关学者[22]在115例冠心病组和194例对照组研究CYP2C19代谢酶的代谢状态，结果发现携带CYP2C19弱代谢类型的女性患者可能更容易发生冠心病，CYP2C19等位基因可能是冠心病发生的一个独立危险因素。国内张瑞等[22]针对CYP2C19基因多态性对冠心病行冠状动脉支架植入手术后服用氯吡格雷患者血小板活性及临床预后的影响进行研究，根据CYP2C19基因型分为正常纯合子组、单突变基因携带组、双突变基因携带组，发现口服氯吡格雷5 d及3个月时二磷酸腺苷诱导的血小板聚集率在三组间均未见明显差异。但双突变基因携帶组半年内非致死性心肌梗死发生率明显升高，因此CYP2C19 681G→A和CYP2C19 636G→A基因多态性与经皮冠状动脉介入术后服用氯吡格雷的冠心病患者预后相关。文献[24]研究表明，CYP2C19*3杂合型使动脉粥样硬化的风险增加3.75倍。关于CYP2C19基因多态性与缺血性脑卒中的国内外研究并不少见[25，26]。本研究发现，CYP2C19 681A基因型和A等位基因在蒙古族人群缺血性脑卒中的发生率明显高于非缺血性脑卒中组。

氯吡格雷的活性代谢产物形成主要由CYP450酶（CYP2C19、2C9、3A4等）介导，其中CYP2C19酶在CYP450酶系统中占主要地位，而CYP2C19基因多态性决定CYP2C19酶的活性。因此，氯吡格雷活性代谢产物的形成受CYP2C19基因型的影响。目前针对缺血性脑卒中与CYP2C19基因多态性的研究主要是对不同地区、不同民族及不同种族之间的缺血性脑卒中与CYP2C19基因多态性的分析[27]。本研究发现CYP2C19 681AG基因型和A等位基因可能与通辽地区蒙古族人群缺血性脑卒中的发生有关，进一步进行多变量Logistic回归分析显示，CYP2C19 681A基因型与蒙古族人群缺血性脑卒中发生相关，可能是缺血性脑卒中的一个独立危险因素。

有研究表明，CYP2C19基因多态性对缺血性脑卒中的影响主要是因为该突变会导致氯吡格雷药效减弱。有文献[28]针对缺血性脑卒中CYP2C19基因型多态性与缺血性脑卒中氯吡格雷抵抗的研究发现，氯吡格雷抵抗组中CYP2C19*2基因型分布明显高于氯吡格雷非抵抗组。本研究关于此基因突变是否可导致氯吡格雷的抗血小板作用减弱，尚需进一步研究。

关于CYP2C19基因多态性是否与冠心病及缺血性脑卒中同时有关系，目前也有相关研究。有文献[29]对急性冠状动脉综合征患者进行研究显示，CYP2C19*2、*3基因型携带者发生缺血性脑卒中的风险较未携带者增加。最近的全基因组关联研究（GWAS）已确定与缺血性脑卒中和冠心病相关的多个基因位点的一些常见的基因变异[30]，但一些最初发现的影响冠心病发生的变异同时与动脉粥样硬化型脑卒中也有关联[31]，而关于是否这两种疾病有共享遗传易感，目前还没有大型数据的系统研究。

综上所述，CYP2C19 681AG基因型和A等位基因可能是通辽地区蒙古族人群缺血性脑卒中发生的独立危险因素。由于本研究样本量有限，还需要扩大样本量进一步深入研究CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性在缺血性脑卒中发病中的作用，冠心病与缺血性脑卒中是否存在共享易感基因也有待于进一步研究。本研究的不足：（1）在研究对象选择上条件不够分明严格，在选择缺血性脑卒中患者未排除同是动脉粥样硬化所致的冠心病及影响冠状动脉粥样硬化的危险因素如高血压、糖尿病等；（2）在检测CYP2C19等位基因多态性时未进一步应用酶切分析；（3）研究对象样本量较少。

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（收稿日期：2017-10-25）