植物乳杆菌L-YL发酵藏红花芦笋复合饮品的研制

刘 义,姚 朗,胡锦蓉,李平兰*

(中国农业大学 食品科学与营养工程学院,教育部-北京市共建功能乳品重点实验室,北京 100083)

植物乳杆菌L-YL发酵藏红花芦笋复合饮品的研制

刘 义,姚 朗,胡锦蓉,李平兰*

(中国农业大学 食品科学与营养工程学院,教育部-北京市共建功能乳品重点实验室,北京 100083)

以含多种活性成分的藏红花、芦笋为主要原料,采用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L-YL进行发酵,研制了一款益生乳酸菌发酵的藏红花、芦笋活菌型复合饮品。通过单因素试验、最陡爬坡试验、响应面试验对发酵复合饮品配方进行优化并验证,得出最佳配方为:藏红花、芦笋粉含量2.50%,酵母粉20.8 g/L,葡萄糖10.0 g/L,乙酸钠1.5 g/L;同时测得复合饮品中植物乳杆菌L-YL活菌数可达7.50×108CFU/mL,多糖含量23.36 mg/mL,总黄酮含量为0.24 mg/mL,研制出了一款具有开发潜力的益生菌发酵复合饮品。

植物乳杆菌;芦笋;藏红花;复合饮品

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)属于革兰氏阳性细菌,多数从植物中分离得到,故命名为植物乳杆菌[1]。该菌是人体胃肠道中常见的益生菌之一,代谢可产生有机酸、细菌素、过氧化氢等多种活性物质,可维持肠道稳态,促进肠道蠕动,降低胆固醇,减少心血管疾病,缓解乳糖不耐症并抑制肿瘤细胞的形成[2-3]。植物乳杆菌是适应力极强的微生物,常存在于发酵的水果和果汁中,并可应用于包括乳、肉、及植物在内的发酵制品中[4]。目前,植物乳杆菌还多用于饮料、益生活菌制剂、胶囊等生产,大量临床试验证明其安全性,同时因其可存活定植于人体胃肠道,从而发挥免疫调节、拮抗致病菌、增强机体健康等优势,受到越来越多的关注[5-6]。在食品发酵过程中,植物乳杆菌可利用食品原料中的糖类,代谢产生乳酸,同时产生胞外多糖、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、抗菌肽等代谢产物[7]。GABA作为一种天然存在的活性物质,有调节血压、抑制动脉硬化、改善肝脏和肾脏功能等作用[8-9]。植物乳杆菌的乳酸发酵在改善食品风味的同时,也改善了产品的营养价值,同时,由于其代谢产生的抗菌物质,可抑制杂菌从而延长产品的保质期[10]。

现代医学研究发现,藏红花具有治疗心血管疾病及预防动脉粥样化、治疗慢性病毒性肝炎及肝硬化的作用,并具抗癌活性、抗氧化能力,可改善乙醇诱发的学习及记忆障碍和提高机体免疫功能等[11-13]。藏红花中藏红花多糖及西红花苷类物质是主要的活性成分。芦笋营养价值极高,被誉为“蔬菜中的人参”,其富含蛋白质、维生素及矿物质,以及各种生物活性物质,包括黄酮类化合物、芦笋多糖、甾体皂甙等,具有降血脂、抗肿瘤的作用[14-15]。

本研究以课题组分离并保存的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L-YL为发酵剂制备发酵藏红花芦笋复合饮品,通过单因素、最陡爬坡及响应面试验对复合饮品进行优化,测定总黄酮、多糖含量并进行感官评价。本研究采用益生菌发酵藏红花芦笋复合饮品,饮品能够包括藏红花、芦笋及植物乳杆菌三者的营养及保健功能,丰富益生菌饮品的种类,对益生乳酸菌活菌产品的研制与开发有着一定意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L-YL:由本课题组分离保存。

藏红花粉、芦笋粉:由山西双锦生物科技有限公司提供。葡萄糖、蔗糖、乙酸钠:西陇化工股份有限公司。

MRS培养基:北京奥博星生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-1800型紫外可见分光光度计:上海美谱达仪器有限公司;YXQ-LS-SⅡ全自动立式电热压力蒸汽灭菌器:上海博讯实业有限公司医疗设备厂;DNP-9102恒温培养箱:上海精宏试验设备有限公司;3K15台式高速离心机:五洲东方科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种的活化

在无菌条件下将备用的植物乳杆菌L-YL接种到MRS培养基中,放置于培养箱中培养,在37℃条件下培养12～15 h,活化2～3代后使用。

1.3.2 发酵液的配置及接种流程

配制待发酵溶液→调节pH至6.9～7.1→离心(常温、8 000 r/min、10 min)→灭菌(115℃、15 min)→无菌条件测pH并调节至6.3～6.5→接种植物乳杆菌L-YL(接种量1%)→置于恒温培养箱培养(37℃、24 h)→测发酵液的OD600nm或活菌数(CFU/mL)。

1.3.3 藏红花芦笋复合饮品种子培养基优化试验设计

将活化三代以上的植物乳杆菌L-YL接种于藏红花、芦笋复合液中,37℃发酵24 h,测定菌株L-YL的活菌数,并以活菌数为响应值,首先进行藏红花、芦笋粉原料适应性评价,进一步采用单因素及最陡爬坡试验确定关键因素的水平范围,以复合饮品OD600nm值(Y)为响应值,用Design Expert 8.0软件进行旋转中心组合设计,并进行结果分析,得到二次线性回归方程,预测最优配方并验证。

1.3.4 复合饮品的指标检测

植物乳杆菌L-YL活菌数量检测采用倾注法平板计数;pH值:用pH计直接测量;多糖含量:采用苯酚-浓硫酸法[16];总黄酮含量:采用分光光度法[17]。

2 结果与分析

2.1 藏红花粉、芦笋粉原料适应性评价

将植物乳杆菌L-YL以1%的接种量,分别接种于质量分数为0.50%、1.00%、2.50%、5.00%的芦笋粉、藏红花粉溶液中,37℃发酵24 h后分别测得的发酵液活菌数如表1。

表1 接种植物乳杆菌对不同质量浓度藏红花、芦笋粉剂溶液活菌数的影响Table 1 Effects ofLactobacillus plantarumL-YL on viable count of saffron,asparagus solution with different concentration

芦笋粉剂含量达5.00%时,发酵液活菌数为0.86×108CFU/mL。藏红花粉剂含量达5.00%及以上时,发酵液活菌数可达2.55×108CFU/mL。由表1可知,虽然随着藏红花、芦笋粉剂含量增加,植物乳杆菌活菌数增加;但含量在2.5%时两者的活菌数均可接近或大于0.50×108CFU/mL,以满足继续优化的基本要求,同时考虑到藏红花及芦笋粉剂的价格,得到活菌数较高、价格适宜的发酵饮品,因此后期进行发酵时藏红花、芦笋粉剂的含量皆为2.50%。

2.2 单因素试验

采用控制变量法找出每个影响因素对发酵有最大影响的最佳质量浓度,为接下来最陡爬坡试验的设计提供依据。各选取一项对发酵液OD600nm值影响显著(P＜0.05)且贡献值最高的因素,即:酵母粉、葡萄糖和乙酸钠,并选取这3个因素进行单因素试验。

图1 酵母粉(a)、葡萄糖(b)及乙酸钠(c)对发酵液OD600nm值影响的试验结果Fig.1 Effects of yeast powder(a),glucose(b)and sodium acetate(c)on OD600nmvalue of the fermentation liquid

由图1数据可知,随着酵母粉、葡萄糖及乙酸钠添加量的增加,OD600nm值都呈先增加后下降的趋势,酵母粉添加量为20 g/L时,发酵液OD600nm值最大为1.064,但当发酵液中酵母粉添加量上升至30 g/L时,OD600nm值下降;在发酵液中添加不同含量的葡萄糖时,OD600nm值也有一定的变化趋势,其中葡萄糖含量为8 g/L的添加量下,发酵液OD600nm值最大为0.585,之后OD600nm值下降;将乙酸钠单因素试验的含量范围控制在0～6g/L时,在1.0g/L得到OD600nm值最大为1.410,之后OD600nm值下降。通过单因素试验得到发酵液中酵母粉、葡萄糖及乙酸钠的最适添加量分别为20g/L、10g/L、1.0g/L。

2.3 最陡爬坡试验

根据单因素试验的结果,将3种影响因素复合,以水平析因中效应值的正负确定爬坡方向,以各因素的贡献值大小确定变化步长,设计最陡爬坡试验,从而逼近响应面拟合方程考察紧邻区域的最佳值域,建立可靠的响应面拟合方程,得到优势配方。

根据2水平析因设计的试验结果,酵母粉、葡萄糖的对效应值(OD600nm)产生正效应,因此浓度变化由递增,乙酸钠的对效应值(OD600nm)产生负效应,因此浓度变化由递减。试验设计及结果如表2所示。根据试验结果,编号3的试验组出现的最高点,即选择酵母粉21 g/L、葡萄糖8 g/L、乙酸钠1.5 g/L作为旋转中心组合设计的中心点。

表2 最陡爬坡试验设计及结果Table 2 Design and results of the steepest ascent test

2.4 响应面试验设计

根据2水平析因设计结果确定的水平,以及单因素试验、最陡爬坡试验确定的中心点的各因素水平,设计旋转中心组合设计试验对复合饮品配方进行响应面分析试验,试验结果见表3。

表3 饮料配方优化响应面试验设计因素与水平Table 3 Factors and levels of response surface methodology for beverage formula optimization

根据旋转中心组合设计的原理,进行3因素3水平的响应面优化试验,共20个试验点,其中中心点重复5次,结果如表4所示,方差分析如表5所示。

表4 饮料配方优化响应面试验设计与结果Table 4 Design and results of response surface experiments for beverage formula optimization

表5 响应面试验回归模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model of response surface experiments

以酵母粉质量浓度(A)、葡萄糖质量浓度(B)、乙酸钠质量浓度(C)为响应因素,植物乳杆菌L-YL活菌数OD600nm值为响应值,利用Design Expert 8.0软件对表4结果进行二次多元回归拟合,得到二次多项回归方程:

表5结果说明,所选模型P=0.000 2＜0.01,表明模型回归极显著,即模型的不同处理间差异显著,说明用回归方程描述各因子与响应值之间的关系时,其应变量与全体自变量之间的线性关系显著,很好地反映了发酵液中植物乳杆菌L-YL的菌体密度OD600nm值与酵母粉质量浓度、葡萄糖质量浓度、乙酸钠质量浓度的关系,该试验方法可靠。失拟值P=0.167 6＞0.05,即失拟检验结果不显著,未知因素对试验的干扰小,试验误差小。R2=0.918 8,方程拟合度较好。同时方程一次项中B(葡萄糖)对OD600nm的影响为极显著(P＜0.01),根据F值可知,3个因素对OD600nm变化影响的大小顺序为B＞C＞A,即葡萄糖＞乙酸钠＞酵母粉。

2.5 CCD试验结果分析及饮品配方优化及验证

图2为两两因素交互作用的等高线图和响应曲面图,结合两种图形与表5方差分析,可判断出各因素之间的交互作用。由图2可知,三个等高线图的等高线均为椭圆形,且响应面图开口向下,说明响应值(OD600nm)在其范围内存在最大值;但由方差分析中,模型P＜0.01及交互项AB、AC、BC的P＞0.05可知,在模型显著的情况下,两两作用(酵母粉与葡萄糖、乙酸钠与葡萄糖、乙酸钠与酵母粉)皆不显著。根据回归模型及藏红花粉、芦笋粉原料适应性评价结果,预测植物乳杆菌L-YL发酵藏红花芦笋复合饮品的最佳配方为藏红花、芦笋粉质量分数2.5%、酵母粉20.84 g/L、葡萄糖9.95 g/L、乙酸钠1.49 g/L,藏红花芦笋复合饮品OD600nm值为1.463。考虑到实际情况的可操作性,将复合饮品的发酵条件改为藏红花、芦笋粉质量分数2.5%、酵母粉20.8 g/L、葡萄糖10.0 g/L、乙酸钠1.5 g/L时。按照此预测配方进行验证试验,得到藏红花芦笋复合饮品OD600nm值达1.432,活菌值达7.50×108CFU/mL,所得结果与预测模型值基本符合。

图2 酵母粉、葡萄糖、乙酸钠质量浓度交互作用对OD600nm值影响的响应面和等高线Fig.2 Response surfaces plots and contour line of effects of interaction between yeast powder,glucose and sodium acetate concentration on OD600nmvalue

2.6 对优化后的发酵复合饮品的评价

优化后发酵复合饮品的各项指标结果如表6所示。

表6 发酵前后复合饮品的指标Table 6 Indexes of compound beverage before and after fermentation

根据发酵前后复合饮品的各项指标变化,可以看出因发酵过程中植物乳杆菌产酸,发酵后酸度增加;发酵终点活菌数可达108CFU/mL以上,符合活菌饮料的活菌数要求。同时藏红花、芦笋中含有一定的多糖及黄酮,经植物乳杆菌发酵后两者皆有增加,最终含量分别为23.63 mg/mL、0.24 mg/mL。

2.7 讨论

含有益生菌乳酸菌的制品中益生菌浓度只有在大于106CFU/mL时才能发挥其益生功效[18]。XIAO Y等[19]以植物乳杆菌B1-6发酵大豆乳清,24 h后活菌数最高可达2.5×108CFU/mL;EMAMIFAR A等[20]发酵橙汁的研究中,植物乳杆菌A7活菌数为3.16×108CFU/mL;本研究通过优化最终得到的植物乳杆菌L-YL发酵藏红花芦笋复合饮品活菌数为7.50×108CFU/mL,相较其他植物乳杆菌发酵产品活菌数较高,具有开发潜力。

藏红花芦笋混合液经植物乳杆菌L-YL发酵后,发酵液中的活性物质,如总黄酮和多糖含量都有增加。其中,发酵前后总黄酮含量由0.16 mg/mL增加至0.24 mg/mL,总黄酮增长49.6%;KIM D S等[21]对植物乳杆菌发酵葛根的研究中也发现发酵后样品总黄酮含量发生变化,增长24.3%。同时发酵前后复合饮品的多糖含量也略有增加,由19.93mg/mL增加至23.63 mg/mL;王路等[22]利用嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌研制玫瑰花发酵饮品,发现发酵后的多糖浓度略大于发酵前,分析可能是随着乳酸菌的发酵产生大量乳酸使体系酸度增加,而酸度的增加有利于藏红花及芦笋多糖的溶出。

3 结论

本研究主要通过响应面等试验对植物乳杆菌L-YL发酵复合饮品配方进行优化,得到配方为藏红花、芦笋粉含量2.5%,酵母粉20.8 g/L,葡萄糖10.0 g/L,乙酸钠1.5 g/L,使发酵藏红花芦笋复合饮品中活菌数达7.50×108CFU/mL,并提高多糖、黄酮两种活性物质的含量至23.63 mg/mL、0.24 mg/mL。该复合饮品以芦笋、藏红花粉剂的溶液为载体,不仅充分利用了植物乳杆菌的益生功效,并将其与芦笋的降血脂、降低肿瘤的发生风险的作用有机结合,利用植物乳杆菌发酵一定程度上提高了饮品中总黄酮及多糖的含量,对后期进一步开发发酵藏红花芦笋复合饮品提供一定的参考。

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LIU Yi,YAO Lang,HU Jinrong,LI Pinglan*
(Key Laboratory of Functional Dairy,Co-constructed by Ministry of Education and Beijing City,College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

Q939.99

0254-5071(2017)11-0165-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.036

2017-06-29

横向合作项目(29016652)

刘 义(1993-),女,硕士研究生,研究方向为食品微生物。

*通讯作者:李平兰(1964-),女,教授,博士,研究方向为食品微生物。