奶牛肺外结核病的综合诊断与病原分离鉴定

许 芳,田莉莉,齐亚银,孙世雄,孙翔翔,剡根强,曾巧英,范伟兴

(1. 中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛 266114;2. 甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070;3. 石河子大学动物科技学院,新疆石河子 832003)

奶牛肺外结核病的综合诊断与病原分离鉴定

许 芳1,2,田莉莉1,齐亚银3,孙世雄1,孙翔翔1,剡根强3,曾巧英2,范伟兴1

(1. 中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛 266114;2. 甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070;3. 石河子大学动物科技学院,新疆石河子 832003)

为揭示牛型提纯结核菌素(PPD)检测阳性牛与剖检肺脏病变不吻合的真实原因,综合运用皮内变态反应(SIT)、比较变态反应(SICCT)、IFN-γ试验,以及牛型PPD点眼反应、ELISA抗体检测等5种免疫学方法,对我国西部5个奶牛场进行牛结核病综合诊断,然后对锁定的后期感染牛进行扑杀、剖检,采集病料进行病理学和病原学诊断.结果显示:用5种方法综合检测确诊的95头后期感染牛中,有84头(88.42%)剖检可见明显结核病变,其中12头(14.29%)的病变发生在肺和肺门淋巴结,72头(85.71%)的病变发生在肝、脾、肠系膜淋巴结等肺外组织器官;95头后期感染牛中,有54头病料培养阳性;阳性菌经Xpert MTB/RIF和Enigma鉴定,均为牛分枝杆菌.该研究结果表明:我国牛结核病存在肺结核和肺外结核两种,因而增加了牛结核病的诊治难度;牛结核病确诊仅靠单一检测方法十分困难,需运用多种免疫学方法进行综合诊断;该结果可以解释目前出现的检测阳性与肺部剖检病变结果不一致的困惑.

牛结核病;综合诊断;病原学诊断;肺外结核

牛结核病主要由牛分枝杆菌引起,经呼吸道传播[1-4],表现为肺及其附属淋巴结核,以组织器官形成结核结节性肉芽肿和干酪样坏死或钙化结节为特征[5-7].我国现行牛结核病诊断方法包括牛型提纯结核菌素(Purified protein derivative,PPD)皮内变态反应(Single intradermal tuberculin,SIT)和新增设的IFN-γ试验.长期以来,我国牛场一直采用SIT方法,对牛群进行牛结核病检疫.但近年来兽医人员和养殖业者在牛结核病检疫过程中很少见到SIT检出的PPD阳性牛肺脏病变.这种检疫结果与肺部剖检病变不一致的现象,使兽医人员和养殖业者产生了很大困惑,甚至出现了对阳性牛扑杀执行难的问题.

2007年以来在全国30个省(直辖市、自治区)开展的牛结核病定点流行病学调查结果也证实,很少在SIT阳性剖检牛的肺脏和胸腔内找到结核病变.10年来,我们对各地用SIT方法检出的1 665头阳性奶牛,用IFN-γ试验进行复核,然后对复核阳性的460头牛进行扑杀剖检,发现仅有7头有肺脏结核病变(其中从4头牛的病料中分离到牛分枝杆菌).这显示SIT检出的PPD阳性牛与剖检病变符合率很低.为了进一步核实PPD阳性牛与剖检病变的相关性和符合率,揭示PPD阳性牛与剖检肺脏病变不吻合的真实原因,本文综合运用SIT、比较变态反应(Single intradermal comparative cervical tuberculin,SICCT)、IFN-γ试验,以及牛型PPD点眼反应、ELISA抗体检测等5种免疫学诊断方法,对我国西部5个奶牛场进行了牛结核病检测,然后锁定后期感染牛,对其扑杀、剖检,采集病料,从免疫学、病理学和病原学方面进行牛结核病确切诊断.

1 材料与方法

1.1 试剂和培养基

牛型PPD(批号155205a)、禽型PPD(批号150605)、BOVIGAM®牛结核分枝杆菌γ-干扰素ELISA检测试剂盒(批号6332000801):购自瑞士Prionics公司;牛分枝杆菌抗体检测试剂盒(批号GM500):购自美国IDEXX公司.DifcoTMLowenstein Medium Base( 批 号5271900)、DifcoTMMycobacteria 7H11 Agar(批号2003747)、DifcoTMMiddlebrook 7H9 Broth(批号5173939)培养基:购自美国BD公司.

1.2 主要仪器

McLintock®结核菌素皮试连续注射器:购自英 国 Bar Knight McLintock公 司;Tecan Infinite®F50酶标仪:购自瑞士Tecan公司.

1.3 试验牛场背景

试验场为我国西部3省的5个规模奶牛场.这些牛场每年应用SIT检测牛结核病.历年阳性检出率在5%～10%之间.历年观察和剖检证明:所有检出的阳性奶牛临床无咳嗽、呼吸困难等呼吸道症状;很少在肺脏和胸腔发现结核病变.

1.4 综合检测策略

对5个奶牛场综合运用5种方法进行检测.用进口结核菌素开展SIT、SICCT、点眼反应,用IFN-γ试验复核,再以牛结核病ELISA抗体检测及牛副结核病ELISA抗体检测作为补充试验(图1).

图1 奶牛场牛结核病综合检测策略

1.4.1 SIT. 操作方法和判定标准按国标(GB/T 18645-2002)执行.

1.4.2 SICCT.在牛只颈部两侧上1/3处剪毛,测量皮皱厚度,分别皮内注射0.1 mL(含3 000 IU)牛型PPD和0.1 mL(含2 500 IU)禽型PPD,72 h后观察并测量皮皱厚度,判定结果.

1.4.3 IFN-γ试验.采集牛全血;对抗凝血用牛型PPD、禽型PPD、PBS(阴性对照)3种刺激抗原进行体外刺激;全血培养16～24 h,收获血浆,用ELISA检测各抗原刺激产生的IFN-γ水平.

1.4.4 牛型PPD点眼反应.对牛眼部进行术前检查后,用1%硼酸棉球擦净眼部外围的污物,以左手食指与拇指使瞬膜与下眼睑形成凹窝,右手持点眼器,滴入2～3滴牛型PPD(30 000 IU/mL,约0.2～0.3 mL),间隔3～5 d后再滴1次.点眼后,于3、6、9 h各观察1次,必要时可观察24 h反应.

1.4.5 ELISA抗体检测.对牛血清50倍稀释后,加100 µL至抗原包被板,18～26 ℃孵育1 h,洗涤后加100 µL酶标抗体,孵育30 min后洗涤,加100 µL TMB避光孵育15 min,终止后在酶标仪450 nm滤光片处读值.

1.5 剖检和病理组织学诊断

剖检后期感染牛,系统检查并无菌采集不同组织器官病料,固定后常规石蜡切片,HE和Ziehl-Neelsen抗酸染色,镜检.

1.6 病原分离鉴定

无菌采集肺、肝、脾、淋巴结等病变组织器官进行细菌分离培养;将组织样品处理后接种于丙酮酸钠、L-J、7H11、7H9培养基,37 ℃温湿培养4～8周,待菌落生长后提取核酸进行Xpert MTB/RIF和Enigma分子鉴定.

2 结果

2.1 5种方法联合检测

将早期(SIT/SICCT/IFN-γ试验)和后期(牛型PPD点眼反应/ELISA抗体检测)综合判定均为阳性的牛锁定为后期感染牛.5个牛场共计检测3 367头牛.经5种方法综合检测锁定后期感染牛194头,剖检95头.5个奶牛场的5种方法检测结果见表1.

表1 5个奶牛场5种方法检测结果

2.2 病理学诊断

95头后期感染牛中84头牛(88.42%)剖检可见有明显结核病变,其中12头(14.29%)在肺和肺门淋巴结,72头(85.71%)在肝、脾、肠系膜淋巴结等肺外组织器官(表2);剩余的11头牛未发现明显眼观病变.对约600份后期感染牛不同组织器官病料进行切片染色.HE染色显示,剖检牛呈早、中、后期不同阶段结核病理变化.Ziehl-Neelsen抗酸染色显示,在15头剖检牛的肺、肝、淋巴结等坏死灶中心处,可见红染杆菌.病理学诊断结果另文发表[8].

表2 5个牛场剖检牛病变及病料分离培养情况

2.3 病原分离鉴定

对5个牛场95头后期感染牛的195份病料进行分离培养,发现54头牛病料培养阳性,阳性率为56.84%(表2).对培养阳性菌进行Xpert MTB/RIF和Enigma鉴定,发现均为牛分枝杆菌(图2).

图2 Xpert MTB/RIF和Enigma检测结果示例

3 讨论

SICCT是英国、加拿大、美国、澳大利亚和新西兰等国家常采用的牛结核病诊断方法[9-11].牛型PPD点眼反应曾经是牛结核检疫规程中的常用方法之一.ELISA方法是较为成熟的血清学诊断方法,可检测牛血清中的牛分枝杆菌抗体.在牛结核病早期感染阶段,细胞免疫占主导地位.SIT、SICCT、IFN-γ试验均是利用分枝杆菌抗原刺激的记忆型T细胞应答进行早期感染诊断的方法.在牛结核病后期感染阶段,体液免疫开始上升.PPD点眼反应和ELISA检测抗体则是针对后期感染的诊断方法.曾在我国牛结核病检疫规程中使用的PPD点眼反应在牛场检疫中也取得了良好效果.

20世纪50年代前后,由于我国奶牛结核病的情况不同,同一检疫方法对不同牛群的检出率也有高有低.多年来的病牛剖检资料和各地实践结果证明,对感染程度较高、病程较久、病变较陈旧的牛群,点眼反应的检出率一般较SIT要高[12].对比较清净、结核病历史较短,以及新感染的牛群,则SIT的检出率较点眼要高.这说明点眼反应的检出水平与结核病变的陈旧程度有着密切关系.而在比较清净的牛群中,SIT检出的结核牛多为处于潜伏期内或新感染的结核病牛.这似乎与结核病变的新鲜检疫一致[12].该病复杂的发病机制导致不同病程对应的主要免疫方式也不同.因此,对不同阶段的牛结核病,只有应用对应的诊断方法,才更易检出感染牛.牛结核病的准确诊断,仅靠单一检测方法十分困难,需运用5种免疫学方法进行综合检测.本研究应用SIT、SICCT、IFN-γ试验,以及PPD点眼反应、ELISA抗体检测5种方法进行综合检测,可提高牛结核病诊断的准确性,排除非特异性阳性牛,且适用于不同流行状况地区或场区的牛结核病控制和净化.牛场可灵活运用综合检测方案,因场施策,分步实施,逐步净化.而且,运用综合检测方法,可最大限度地检出感染牛,减少漏检,且易检出有病变的牛,提高检测阳性与剖检病变的符合率.

针对PPD阳性牛与肺脏剖检病变不一致的原因,长期以来占主导性的观点认为牛结核是一种以潜伏性感染为主的慢性传染病.我国感染牛基数大,被扑杀的大部分牛可能处于潜伏感染或尚未产生肉眼可见病变阶段[13].因此多数皮试阳性动物的肺脏和胸腔中找不出结节样病灶或分离不出菌株[14].但事实是,我国现行PPD检疫阳性牛的处置方法是不剖检而直接进行无害化处理,即使剖检也往往仅检查肺和胸腔而非进行系统检查,因此缺乏对PPD阳性牛开展系统剖检和病理组织学诊断的机会.这就使上述观点长期以来一直停留在猜测阶段,而未得到PPD阳性与剖检、病原学之间的相互认证.针对上述主观观点,本研究运用5种方法综合检测,确定后期感染牛,并对其进行剖检,以及病理学和病原学诊断,证明88.42%的PPD阳性牛不是检查不到肉眼可见结核病变,而是这些病变主要分布在肺外组织器官,表现为肺外结核.该研究结果可以解释兽医人员和养殖业者对检测结果与剖检病变不一致的困惑.这种情况可能在我国其他规模奶牛场也存在.当然,尚需同行们开展更多工作来验证上述结论.

查阅国内外文献,并没有找到有关奶牛肺外结核的报道.而人的肺外结核在国内外均有大量报道.研究表明人肺外结核是由反复吞咽含结核分枝杆菌痰液或食用带菌牛奶和乳制品引起的[15-16].因此,牛肺外结核也可能是由于犊牛饮用被牛分枝杆菌污染的牛乳或饲草料而感染,最有可能的传播途径为消化道和粪口传播.这提示我们在牛结核病的防控中必须注重牛奶的巴氏灭菌消毒和防止饲草料被结核菌污染.这一问题也对现代规模化奶牛场的结核病防控提出了新的挑战和课题,应引起相关主管部门、业务部门和养殖业者的关注.

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(责任编辑:朱迪国)

Integrated Immunological Diagnosis of Extrapulmonary Tuberculosis for Dairy Cows Combining with Pathogenic Isolation and Identification

Xu Fang1,2,Tian Lili1,Qi Yayin3,Sun Shixiong1,Sun Xiangxiang1,Yan Genqiang3,Zeng Qiaoying2,Fan Weixing1
(1. China Animal Health and Epidemiology Center,Qingdao,Shandong 266114;2. College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou,Gansu 730070;3. College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003)

In order to reveal the true reason why there was inconsistence between PPD positive cattle and their autopsy lesions in lungs,5 kinds of bovine tuberculosis immunological diagnosis methods,including SIT,SICCT,IFN-γ test,bovine PPD eye-drops reaction and ELISA antibody detection,were adopted to carry out a synthetic detection towards 5 dairy farms of western China. Then the infected cows at late stage were locked,killed and necropsied,the pathological samples were collected for pathological and etiological diagnosis. Based on the results,among the 95 positive cows that were locked through five detection methods,84 cows(88.42%)were found to have obvious tuberculosis lesions,lesions of 12 cows(14.29%)were in lung and hilar lymph nodes,lesions of the rest 72 cows(85.71%)were found in extrapulmonary tissues and organs,such as liver,spleen and mesenteric lymph nodes,etc.Pathological samples of 54 cows were cultured positive among the 95 cows,and all the positive bacteria were identified as Mycobacterium bovis by Xpert MTB/RIF and Enigma. The results suggested that it was more difficult to diagnose and prevent bovine tuberculosis because pulmonary tuberculosis and extrapulmonary tuberculosis were both present in China. It was very difficult to use single detection method for diagnosis of bovine tuberculosis,so using integrated immunological diagnosis were essential. And the results also could explain the confusion that the positive detection results were inconsistent with their lung lesions at necropy.

bovine tuberculosis;integrated diagnosis;etiological diagnosis;extrapulmonary tuberculosis

S855.2

A

1005-944X(2017)12-0001-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.12.001

甘肃农业大学伏羲杰出人才项目;现代农业(奶牛)产业技术体系建设项目(CARS-36)

曾巧英、范伟兴