进口基因检测用动植物DNA/RNA风险分析

种 焱,张兆平,马树宝,孙 博,许文燕,徐 晶

(1. 北京出入境检验检疫局,北京 100026;2. 中关村联合创新(北京)生物科技有限公司,北京 102206)

进口基因检测用动植物DNA/RNA风险分析

种 焱1,张兆平1,马树宝1,孙 博1,许文燕1,徐 晶2

(1. 北京出入境检验检疫局,北京 100026;2. 中关村联合创新(北京)生物科技有限公司,北京 102206)

近年来,我国在基因检测方面正在积极抢占国际市场份额.然而该产业的时效性要求很高,因此进出口通关效率至关重要.北京出入境检验检疫局在对进口基因检测用动植物DNA/RNA进行系统地风险分析后认为,经纯化的动植物DNA/RNA不具备感染其它生物体的条件,无传染性,检疫风险极低,并据此提出了检疫监管建议.

检疫监管;风险评估;基因检测;DNA;RNA

近年来基因检测行业发展迅速.2015年全球基因测序市场规模接近60亿美元,2016年超过了60亿美元,直逼70亿美元,预计2018年全球市场规模将达到117亿美元,未来4年年复合增长率将达到21%[1].我国在基因检测方面正在积极抢占国际市场份额.然而该产业的时效性要求很高,因此进出口通关效率对产业发展至关重要.

1 基本情况

1.1 DNA/RNA定义

核酸是遗传信息携带者,是生命的最基本物质.它和蛋白质是构成生物体的主要成分.按化学组成,可以将核酸分成两大类:脱氧核糖核酸(DNA),主要存在于细胞核中;核糖核酸(RNA),主要存在于细胞质中.在生物体中,核酸以结合成核蛋白的形式存在,但其极不稳定,在较剧烈的物理、化学因素和酶的作用下都很易降解.

本文所指动植物DNA/RNA为商业化基因测序用途的动植物DNA/RNA,不包括微生物DNA/RNA.

1.2 产业发展历程

基因检测的发展已经历了3个阶段:

第1阶段,1987年第1台自动化测序仪ABI370问世(Sanger测序法),并被广泛运用于科研和临床.但Sanger测序法因有对电泳分离技术依赖的局限性,以及无法再进一步扩大和微量化,造成出现序列测定的规模限制和高昂代价.如,绘制第l张人类基因组图谱,前后就耗费了13年时间.

第2阶段,以Roche公司的454技术,Illumina公司的Solexa、Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第2代测序技术诞生.第2代测序技术的出现,使基因研究快速发展,测序成本大大降低.据资料显示,全基因组测序在2001年需耗费100万美元,而在第2代测序技术的帮助下,2011年已经下降到1万美元;人的全基因组测序只需一周左右时间即可完成.近年来,随着2代测序技术的蓬勃发展,高通量的基因测序技术日臻成熟,逐渐从常规基础科研实验室应用转入临床医学应用.

第3阶段,以PacBio公司的SMRT和Oxford nanopore technologies纳米孔单分子测序技术为代表,被称之为第3代测序技术.与前两代相比,其最大的特点就是单分子测序,测序过程中无需进行PCR扩增.2011年发布的 PacBio RS系统已成为首个成熟商业化应用的第3代测序平台.2015年推出的全新PacBio sequel 测序平台,通量更高、体积更小,测序成本更低,可大大缩短项目周期.第3代测序平台已被用于临床寻找基因致病突变.

1.3 产业发展需求

随着经济的不断发展和测序市场的规范化,我国测序市场发展增速明显,已进入快速发展期.2016年测序市场规模约为54亿元人民币,预计2020年将突破百亿元人民币,年复合增长率预计为20%～25%.基因检测时效性要求极高,国外一般要求在10～15个工作日内出具检测报告(含国际运输、清报关和上机检测).因此,样品进口速度直接影响到我国基因检测产业的发展.

2 风险评估

本文通过定性分析进口基因检测用DNA/RNA的分离纯化、包装运输和检疫瞒报风险,评估检疫风险,进而提出检疫监管建议.

2.1 传入评估

2.1.1 DNA/RNA的分离与纯化工艺.采用quot;物理+化学quot;方法,去除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染,分离纯化DNA/RNA.

2.1.1.1 动物组织DNA的提取方法.SDS法:将分散好的组织细胞放入含SDS(十二烷基硫酸钠)和蛋白酶K的溶液中进行蛋白质消化分解,再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,将得到的DNA溶液,用乙醇沉淀,使DNA从溶液中析出.

2.1.1.2 植物组织DNA的提取方法.CTAB法:CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)在高离子强度的溶液中(gt;0.7 mol/L NaCl),可与蛋白质和多聚糖形成复合物,仅不能沉淀核酸.利用有机溶剂抽提去除蛋白多糖酚类等杂质后,加入乙醇沉淀,即可将核酸分离出来.

2.1.1.3 血液DNA的提取方法.主要采用quot;红细胞裂解+SDSquot;法.

2.1.1.4 RNA提取方法.目前的RNA提取均采用成品试剂盒.比如,对动物组织/细胞,采用动物组织/细胞RNA提取试剂盒(RNApureTissueamp;Cell Kit);对植物RNA,采用植物RNA提取试剂盒(RNApure Plant Kit);对血液RNA,采用天根血液RNA提取试剂盒(RNApure Blood Kit).

2.1.2 纯化不彻底的检疫风险.制备动植物组织、微生物、血液样品DNA及RNA的工艺和方法,均使样品中的蛋白质得到化学变性(SDS、CTAB等)处理,从而使其不再具备生物活性,因而提纯后的DNA和RNA样品不再有传染性和造成疫病传播的可能性.

2.1.3 实验环境污染的检疫风险.DNA制备所需的所有试剂(SDS、CTAB、EDTA、酚氯仿、乙醇等)均为常规的化学试剂,无传染性,不会造成疫病传播风险.

2.1.4 制备后感染病原微生物的可能性评估.通过DNA和RNA制备工艺处理后,保存液中(纯水)仅有纯化的DNA和RNA,不存在任何具有传染性和可能造成疫病传播风险的化学试剂.且在纯水的环境下,DNA和RNA亦不具备合成蛋白质或者侵染组织细胞的能力,因而无传染性,不会造成疫病传播风险.同时,出于商业要求,基因检测用DNA/RNA在出口前均经过了严格的完整性和纯度验证,可确保其检测结果的可靠性.因此,进境基因检测用动植物DNA/RNA样本自身检疫风险极低.

2.2 暴露发生评估

2.2.1 样本运输的质量控制.通常DNA溶液需要-20 ℃冷冻保存.如果长期保存(≥2年)最好是-40 ℃或者-80 ℃保存.使用TE缓冲液溶解DNA,有助于保持DNA的稳定性.对RNA,建议保存在-80 ℃冰箱中.另外,由于环境中的RNase无处不在,提纯的RNA容易被降解,所以RNA的保存需要使用DEPC水等去除RNase活性的灭菌去离子水.

2.2.1.1 干冰运输 .根据干冰量,准备大小适当的泡沫盒;在其中放入干冰(需要10 kg,至少为8 kg)和标本(用塑料袋或者塑胶手套装好),将盒子内的空隙用旧报纸塞满,以防干冰挥发后有液体流出.干冰运输时需选择较厚的泡沫盒;在运输过程中为避免因保存管破裂而导致的DNA/RNA溶液污染,需使用封箱带密封泡沫盒;最后将其放入纸箱内,再次用封箱带密封.

2.2.1.2 冰袋运输.将需要提取RNA的细胞或组织样品溶解在Trizol溶液中.短期运输过程(≤5 d)中可以使用冰袋.

2.2.1.3 液氮运输.运输时间超过5 d时,可以适当采用液氮运输.将装有DNA/RNA样品的保存管包装、密封,投入干式液氮罐中密封运输.注意事项:将收集的各类样品用冻存管或离心管装好,保存在低温冰箱或者液氮中;对所使用的1.5 mL冻存管或离心管、枪头等,必须进行高温灭菌处理;装好样品后,将管口以封口膜封好;对冷冻的DNA/RNA样品,应避免反复冻融.

2.2.1.4 样本运输过程中的查验.对样本查验等较暴露处理过程,均采取2人合作的方式.这样既缩短了样本在非超低温环境中停留的时间,又形成了对样本的双重检查,保证了样本信息的准确性.为保证样本质量,样本的查验、使用者信息反馈及样本质量检测均按照样本运输的标准化流程严格操作.在信息化管理方面,采用二维码标签,严格管理样本运输节点,对每份样本均可通过二维码追溯到样本供应者的基本信息资料,健康状况及样本采集、运送、接收、存放情况,目前使用情况和使用中产生的其他信息资料,销毁的记录以及后续监管所需信息.

2.2.2 样本瞒报的检疫把关.目前对DNA/RNA样本完整性和纯度控制常用的方法有电泳法、分光光度法.电泳法主要用于测定样本的完整性,分光光度法主要用于鉴定其纯度(表1).检疫执法把关中,在无法确定样本纯度的情况下,必要时通过分光光度法,快速鉴定进口样本是否为DNA/RNA,从而堵住检疫瞒报漏洞.因此,DNA/RNA包装运输安全可靠,纯度鉴定简单易行.

表1 基因检测用DNA/RNA质量控制

2.3 相关国家检疫要求参考

经调研欧洲区亚太区相关人员,科研用的NDA/RNA进口一般不需要任何证明或审批.有些城市可能会要求出具保证函、非危保函,此时可个人签名出具即可.

美国农业部(USDA)在其网站上明确列明了以下材料进口不需要农业部进口许可证,但将在入境口岸审查(图1).

图1 美国农业部(USDA)无需进口许可部分产品名单

3 评估结论

由上述分析可判定:

(1)采用quot;物理+化学quot;方法所提纯的检测用动植物DNA/RNA均具有传染性.

(2)检测用动植物DNA/RNA在制备过程中全部使用化学试剂,且制备环境要求严格,因此在中间环节污染的可能性极低.

(3)制备后的成品经洗净处理后,保存于纯水环境中,因此在保存、运输环节被污染的可能性极低.

(4)所有检测用DNA/RNA经提纯后均要经过纯度和完整性验证,可确保其可靠性.

(5)经过纯化的DNA/RNA均已被解链、暴露,在没有相关酶、引物和寡核糖核苷酸的情况下,其复制、转录/反转录等生理机制不可能发生,即使是微生物遗传物质,也不存在传染的可能.

因此,经纯化的动植物DNA/RNA不具备感染其它生物体的条件,无传染性.

4 检疫监管建议

鉴于基因检测用动植物DNA/RNA均经过提纯、灭活、固定等处理,不具有携带、传播动植物疫病的可能.为满足产业发展需求,提升进出口效率,建议如下:

对基因检测用进境动植物DNA/RNA,进口时只需随附国外提供者出具的成分说明和安全声明,口岸查验合格后,即可直接放行,必要时只需通过分光光度法进行纯度鉴定.

对于进境的致病性微生物DNA/RNA,由于后期改造后仍具有传染性,出于生物安全考虑,进口检疫时需从严要求.

[1] 邓和平,廖晓磊. 全球基因测序领域专利分析[J]. 中国发明与专利,2017,14(3):39-44.

[2] 基因测序行业报告[EB/OL].(2015-10-27)[2017-08-16]. http://www.360doc.com/conte nt/15/1027/22/4102591_508834732.shtml.

[3] 基因测序市场行业分析:谁主沉浮?[EB/OL]. (2017-02-12)[2017-08-16]. http://www.instrument.com.cn/news/20170212/212726.shtml.

(责任编辑:朱迪国)

Risk Assessment for Animal and Plant DNA/RNA Used in Gene Detection during Importation

Chong Yan1,Zhang Zhaoping1,Ma Shubao1,Sun Bo1,Xu Wenyan1,Xu Jing2
(1. Beijing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Beijing 100026;2. Beijing Zhongguancun Biocenter Co.,Ltd,Beijing 102206)

In recent years,China is actively seizing the international market share in the field of gene detection.However,the timeliness of the industry is very high,so the efficiency of import and export customs clearance is crucial. Based on the systematic risk assessment for animal and plant DNA/RNA used in gene detection during importation by Beijing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,it was considered that the purified animal and plant derived DNA/RNA didn't have the ability to infect other organisms,with no infectivity and extra-low quarantine risk. And suggestions for quarantine supervision were put forward accordingly.

quarantine and inspection;risk assessment;genetic test;DNA;RNA

S851.33

A

1005-944X(2017)12-0039-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.12.010

马树宝