姜黄素抑制多药耐药肝癌细胞HepG2/ADM的增殖及其机制研究*

耿燕娜,尹元元,武毅君，张文鑫

(1.河南大学淮河医院药学部，河南开封 475000；2.河南大学药学院，河南开封 475000; 3.河南中医药大学第一附属医院，郑州 450000)

姜黄素抑制多药耐药肝癌细胞HepG2/ADM的增殖及其机制研究*

耿燕娜1,尹元元1,武毅君2，张文鑫3△

(1.河南大学淮河医院药学部，河南开封 475000；2.河南大学药学院，河南开封 475000; 3.河南中医药大学第一附属医院，郑州 450000)

姜黄素；多药耐药；P-糖蛋白；HepG2/ADM细胞

GengYanna1,YinYuanyuan1,WuYijun2,ZhangWenxin3△

多药耐药(MDR)是指对一种药物具有耐药性的同时，对其他结构不同、作用靶点不同的药物也具有耐药性。MDR通常是导致抗感染药物治疗和抗肿瘤化疗失败的重要原因。通常来说，细菌的MDR主要与内酰胺酶的变异有关，而肿瘤细胞的MDR通常与细胞膜上过度表达外排抗肿瘤药物的蛋白有关，如：MDR基因mdr-1编码的P-糖蛋白(P-gp)过度表达是其重要原因之一，P-gp能够将亲脂类化疗药物泵出细胞外，从而产生耐药特性[1]。

肝癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，由于我国是乙型肝炎病毒(HBV)的高发区，因此，受肝癌威胁也最大，约占全球肝癌病死率的50%。尽管，治疗肝癌的手段有了很大的提高，但由于MDR的存在，使得其化疗的疗效不尽如人意，因此寻找新的治疗策略逆转肝癌的MDR就显得极其重要。

姜黄素(Curcumin)是从姜科植物姜黄中提取的一种酚类化合物，具有显著的抗炎[2]、抗氧化[3]、抗缺血[4]、抗纤维化[5]、抗肿瘤[6]等生物活性。故本实验用阿霉素(ADM)处理肝癌细胞株HepG2制备耐药细胞株HepG2/ADM，用姜黄素处理该细胞，观察其对该细胞的杀伤作用，并探讨其抗耐药的机制。

1 材料与方法

1.1试剂 HepG2肝癌细胞株购置中科院上海生科院细胞资源中心；姜黄素购自美国Sigma公司，纯度大于96%，并用二甲基亚砜(DMSO)溶解，等量分装，并-20 ℃保存备用；ADM购自深圳万乐药业有限公司，用双蒸水稀释保存。RPMI-1640培养液、0.25%胰酶和胎牛血清购自美国Gibco公司；CCK-8试剂盒购自上海生博生物医药科技有限公司；反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒购自大连宝生生物工程有限公司，mdr-1引物由美国Invitrogen公司设计并合成。P-gp单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，内参抗体β-actin购自博鳌森生物有限公司。

表1 姜黄素对肝癌HepG2/ADM细胞增殖的抑制作用

*：P<0.01，与空白对照组或DMSO组比较；△：P<0.05,与同组内24 h比较

1.2方法

1.2.1细胞培养和HepG2/ADM的制备 HepG2肝癌细胞贴壁生长于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素的RPMI-1640培养液中，置于37 ℃、5% CO2的饱和湿度的培养箱中培养。耐药细胞株的建立采用AMD大剂量冲击和剂量递增相结合的方法诱导产生，具体做法：测定AMD对HepG2细胞的最低耐受浓度，用终浓度为1 mg/L的AMD与细胞共培养24 h，存活细胞用含最低AMD耐受浓度的培养液共培养7～10 d，待细胞稳定后传代，再次用含1 mg/L的AMD的培养液共培养24 h，存活细胞接种于含较高浓度的AMD中，以此类推，直至HepG2细胞在含1 mg/L的AMD下稳定生长和传代，即建立耐药菌株HepG2/ADM[7]。

1.2.2CCK-8试剂检测姜黄素对HepG2/ADM细胞的杀伤作用 将处于对数生长期的HepG2/ADM细胞以1×104/孔接种于96孔板中，培养12 h细胞贴壁后，将不同浓度的姜黄素(5、10、20、40 mol/L)加入HepG2/ADM培养体系中，继续培养24、48、72 h。在培养相应时间点后加入10 μL的CCK-8试剂，37 ℃孵育2 h，于酶标仪上490 nm处比色。根据公式计算细胞活力：细胞活力(%)=A490处理组/A490自然生长组×100%。

1.2.3R-123外排实验 将处于对数生长期的处理的HepG/ADM细胞以2×104/L接种于24孔板内，每孔终体积为1 mL。培养24 h后，弃上清液，加入R-123至终浓度为5 mg/ L，然后加入姜黄素(20 mol/L)，联合继续培养0、0.5、1、2 h后，收集上清用流式细胞仪上检测(激发波长560 nm，发射波长 540～660 nm)R-123激发的荧光强度值表示细胞内R-123浓度。

1.2.4RT-PCR 收集培养的各组HepG2/ADM细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)充分洗涤后，参照Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，用RT-PCR检测各组细胞中mdr-1基因的表达量。mdr-1上游引物：5′-GTA CCC ATC ATT GCA ATA GC-3′；下游引物：5′-CAA ACT TCT GCT CCT GAG TC-3′，扩增产物大小为167 bp。内参GAPDH上游引物：5′-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3′；下游引物：5′-AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3′，扩增产物大小为228 bp。扩增条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸5 min,35个循环;72 ℃ 延伸 7 min。扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳,凝胶成像扫描。用Quantity One灰度分析软件进行吸光度值计算。以目的基因mdr-1条带灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值作为mdr-1 mRNA的表达量，并重复3次。

1.2.5Western blot 收集各组细胞提取总蛋白，并测定蛋白的浓度为(2.12±0.24)mg/mL。取蛋白样品20 μL，经过SDS-PAGE电泳后，将蛋白电转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，以5%脱脂奶粉TBST液封闭后，加入P-gp抗体4℃孵育过夜，洗涤后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温孵育1 h后，ECL底物化学发光显色后曝光显影。通过Chemi DocXRS化学发光成像系统，进行曝光分析，然后计算其比值表示结果，即：相对吸光度=目的蛋白P-gp吸光度/ β-actin 蛋白吸光度。

2 结 果

2.1姜黄素抑制HepG2/ADM细胞的增殖 与空白对照组和DMSO组比较，当姜黄素浓度为5、10 mol/L作用24 h时，对HepG2/ADM细胞的增殖活力无明显影响(P>0.05)；而当姜黄素浓度增加至20、40 mol/L时，其对肝癌细胞的增殖活力有明显的抑制作用，呈剂量-依赖性(P<0.05)。进一步发现，随着作用时间的逐渐延长，不同浓度的姜黄素对HepG2/ADM细胞的增殖活力都有显著的抑制作用，呈时间-依赖性(P<0.05)。见表1。

2.2姜黄素对肝癌HepG2/ADM内R-123浓度的影响 流式细胞结果如图1显示：与空白对照组和DMSO组比较，当姜黄素浓度为5、10 mol/L时，在每一个时间点，姜黄素对HepG2/ADM细胞内的R-123的外排无明显抑制作用，而当浓度增加至20、40 mol/L时，在每一个时间点，姜黄素都能够明显地抑制细胞内R-123的外排，即：增加了细胞内ADM的药物浓度。

*:P<0.05，与空白对照组或DMSO组比较

图1姜黄素对肝癌HepG2/ADM内R-123浓度的影响

2.3姜黄素抑制了耐药肝癌HepG2/ADM细胞内mdr-1 mRNA及其编码的P-gp的表达 PCR和Western blot结果显示，与空白对照组或DMSO组比较，当姜黄素浓度为10 μmol/L时，HepG2/ADM细胞内mdr-1 mRNA及其编码的P-gp的表达水平无明显差异(P>0.05)；当姜黄素浓度增加至20 μmol/L时，mdr-1 mRNA和P-gp水平表达的相对OD值都有显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，具有浓度依赖性(图2A和C)。进一步结果还显示，当姜黄素浓度为20 μmol/L时，随着药物作用时间的延长，HepG2/ADM 胞内mdr-1 mRNA和P-gp水平的相对OD值都逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.01)，呈时间依赖性(见图2B和D)。

A：不同浓度的姜黄素对耐药肝癌HepG2/ADM细胞内mdr-1 mRNA表达水平的影响；B：20 μmol/L 的姜黄素作用不同时间后对耐药肝癌HepG2/ADM细胞内mdr-1 mRNA表达水平的影响；C：不同浓度的姜黄素对耐药肝癌HepG2/ADM细胞内P-gp蛋白表达水平的影响；D：20 μmol/L 的姜黄素作用不同时间后对耐药肝癌HepG2/ADM细胞内P-gp蛋白表达水平的影响

图2姜黄素对耐药肝癌HepG2/ADM细胞内mdr-1 mRNA和P-gp蛋白表达的影响和比较

3 讨 论

MDR不仅是肿瘤治疗过程中常见的问题之一，也是其面临的巨大挑战。耐药的肿瘤细胞能够有效地从细胞内部防止抗瘤药物的积聚，从而降低肿瘤细胞对抗瘤药物的敏感度[8]。MDR形成的原因多样，如P-gp的过度表达[1]，上游通路(NF-kappB和PI3K)活性的异常等[9]。其中，mdr-1基因及其编码的P-gp在多种恶性肿瘤细胞中的过度表达是形成MDR的重要机制，也是肿瘤患者化疗效果差、预后差、复发率高的重要原因。

肝癌是消化系统最为常见的恶性肿瘤之一，因P-gp高表达引发MDR从而导致肝癌病死率居高不下，因此寻找有效的MDR逆转剂一直是肝癌防治研究的热点。 目前越来越多的研究表明，许多植物提取物，如：绿茶[10]、白藜芦醇[11]等，因其广泛的药理特性和低毒性，在肝癌的治疗和预防中有广阔的应用前景，但这些提取物对MDR的肝癌的治疗作用及其机制却鲜有研究。

姜黄素是一种多酚类植物提取物，因其良好的抗突变和抗癌作用，使其成为一种很有应用前景的抗癌药物。本研究利用姜黄素处理MDR的肝癌细胞株HepG2/ADM，观察姜黄素对该细胞株的增殖作用的影响，并探讨其机制。研究表明，姜黄素能够明显地抑制耐药肝癌细胞的增殖，且这种抑制作用呈明显的浓度-时间依赖性(P<0.01)。流式细胞术检测了姜黄素对R-123的影响，结果发现姜黄素也能够明显抑制细胞内R-123的外排，也就是说姜黄素可以明显增加细胞内ADM的药物浓度，使其增强抗肝癌的作用。进一步的研究结果表明，姜黄素能够明显抑制与MDR密切相关的mdr-1 mRNA及其编码的P-gp的表达水平，也呈浓度-时间依赖性。

总之，本研究显示姜黄素能够逆转人肝癌耐药细胞株HepG2/ADM的耐药作用，其机制可能与抑制mdr-1及其编码的P-gp的表达有关系，这或为治疗耐药肝癌指出了新的方向，也提供了一定理论依据，但其逆转耐药的确切机制仍有待深入研究。

[1]Liu Z,Duan ZJ,Chang JY,et al.Sinomenine sensitizes multidrug-resistant colon cancer cells (Caco-2) to doxorubicin by downregulation of MDR-1 expression[J].PLoS One,2014,9(6):98560.

[2]Machova Urdzikova L,Karova K,Ruzicka J,et al.The anti-inflammatory compound curcumin enhances locomotor and sensory recovery after spinal cord injury in rats by immunomodulation[J].Int J Mol Sci,2015,17(1):E49.

[3]Xiong ZE,Dong WG,Wang BY,et al.Curcumin attenuates chronic ethanol-induced liver injury by inhibition of oxidative stress via mitogen-activated protein kinase/nuclear factor E2-related factor 2 pathway in mice[J].Pharmacogn Mag,2015,11(44):707-715.

[4]Shah FA,Gim SA,Sung JH,et al.Identification of proteins regulated by curcumin in cerebral ischemia[J].J Surg Res,2016,201(1):141-148.

[5]Liu PY.Curcumin:another potential translational candidate for anti-fibrosis on heart failure?[J].Acta Cardiol Sin,2014,30(5):483-484.

[6]Pan Z,Chen C,Zhou Y,et al.Synthesis and cytotoxic evaluation of monocarbonyl analogs of curcumin as potential anti-tumor agents[J].Drug Dev Res,2016,77(1):43-49.

[7]Zhai BJ,Shao ZY,Zhao CL,et al.Development of characterization of multidrug resistant human hepatocarcinoma cell line in nude mice[J].World J Gastroenterol,2006,12(41):6614-6619.

[8]Fletcher JI,Haber M,Henderson MJ,et al.ABC transporter in cancer:more than just drug efflux pumps[J].Nat Rev Cancer,2010,10(2):147-156.

[9]Fey SJ,Wrzesinski K.Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line[J].Toxicol Sci,2012,127(2):403-411.

[10]Zhang Y,Duan W,Owusu L,et al.Epigallocatechin-3-gallate induces the apoptosis of hepatocellular carcinoma LM6 cells but not non-cancerous liver cells[J].Int J Mol Med,2015,35(1):117-124.

[11]Lombardi G,Vannini S,Blasi F,et al.In vitro safety/protection assessment of resveratrol and pterostilbene in a human hepatoma cell line (HepG2)[J].Nat Prod Commun,2015,10(8):1403-1408.

StudyoneffectofcurcuminininhibitingproliferationofmultidrugresistantlivercancerHepG2/ADMcellsanditsmechanism*

(1.DepartmentofPharmacy,HuaiheHospital,HenanUniversity,Kaifeng,Henan,475000;2.CollegeofPharmacy,HenanUniversity,Kaifeng,Henan,475000;3.FirstAffiliatedHospital,HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou,Henan450000,China)

ObjectiveTo observe the inhibitory effect of curcumin on the proliferation of multidrug resistance liver cancer line HepG2/ADM cells and to explore its mechanisms.MethodsHepG2/ADM cells were prepared and cultured in vitro,and treated by different concentrations (5,10,20,40 μmol/L) of curcumin for 24,48,72 h respectively.The effect of curcumin on proliferation of HepG2/ADM cells was measured by CCK-8 reagent;the concentration of intracellular rhodamine-123(Rh-123) and adriamycin (ADM) were determined by flow cytometry;the level change of intracellular mdr-1 mRNA in each group was determined by RT-PCR,the P-gp protein level was detected by Western blot.ResultsCompared with the blank control and DMSO group,curucmin had more obvious inhibitory effect on HepG2/ADM cells proliferation (P<0.05),and could more remarkably inhibit the intracellular Rh-123 excretion(P<0.05).The RT-PCR and Western blot results showed that curcumin more significantly decrease the mdr-1 mRNA and P-gp protein levels in dose-time dependent manner (P<0.05).ConclusionCurcumin could significantly inhibit the proliferation of multidrug-resistant HepG2/ADM cells,and its mechanism may be related with inhibiting mdr-1 gene expression and its encoded P-gp protein level,which are closely related with MDR.

curcumin;multidrug-resistance;P-gp;HepG2/ADM cells

目的观察姜黄素对多药耐药(MDR)的肝癌细胞株HepG2/ADM细胞增殖的抑制作用及其机制。方法制备、培养HepG2/ADM细胞，然后用不同浓度的姜黄素(5、10、20、40 mol/L)处理该细胞24、48、72 h。采用CCK-8试剂检测姜黄素对HepG2/ADM细胞的增殖活力的影响。流式细胞仪检测细胞内罗丹明123(R-123)的浓度和阿霉素(ADM)的浓度；反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组细胞内mdr-1 mRNA的水平变化；用Western blot检测细胞内P-糖蛋白(P-gp)水平的变化。结果与空白对照组和DMSO组相比，姜黄素对HepG2/ADM细胞增殖的抑制作用更加明显(P<0.05)；更能够明显抑制细胞内Rh123的外排(P<0.05)；RT-PCR和Western blot结果分别显示，姜黄素对HepG2/ADM细胞内的mdr-1 mRNA和P-gp水平更有明显的降低(P<0.05)，且呈浓度-时间依赖性(P<0.05)。结论姜黄素可以显著抑制多药耐药HepG2/ADM细胞的增殖，其机制可能与抑制和MDR密切相关的mdr-1基因及其编码的P-gp水平有关。

R962

A

1671-8348(2017)31-4329-03

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.31.003

河南省医学科技公关计划项目(201404035)。

耿燕娜(1983-)，副主任药师，硕士，研究方向为中药药理与临床药学。△

，E-mail：zhangwenxin1983@163.com。

2017-03-20

2017-06-08)