入侵害虫梣粉虱的种特异性SS-COⅠ检测技术

张桂芬， 王玉生， 冼晓青，2， 万方浩，2， 邵嘉文

入侵害虫梣粉虱的种特异性SS-COⅠ检测技术

张桂芬1，2∗， 王玉生1， 冼晓青1，2， 万方浩1，2， 邵嘉文3

1中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京100193；2农业部外来入侵生物预防与控制研究中心，北京100193；3青岛农业大学农学与植物保护学院，山东青岛266109

【目的】梣粉虱是新近入侵中国大陆的一种危险性果树和园林植物害虫，针对其体型微小，与近缘种粉虱形态相仿，很难快速准确区分的问题，以田间常见的11种/隐种粉虱为参考，采用基于mtDNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(mitochondrial DNA cytochrome c oxidase subunitⅠ，mtDNA COⅠ)基因的物种特异性(species-specific COⅠ，SS-COⅠ)PCR法，研究梣粉虱快速分子检测鉴定技术。【方法】利用mtDNA COⅠ基因通用型引物对LCO-1490/HCO-2198获得梣粉虱和其他常见粉虱的COⅠ基因序列，根据测序结果设计梣粉虱特异性SS-COⅠ引物1对(SPZWCF1/SPZWCR1)，之后确定其对目的片段的扩增长度，并对该引物对的物种特异性和检测灵敏性进行检验。【结果】引物对SPZWCF1/SPZWCR1扩增片段的长度为426 bp。物种特异性检验结果显示，该对引物只对梣粉虱的mtDNA COⅠ基因具有扩增效果，对我国常见的其他种类的粉虱包括5种烟粉虱隐种(AsiaⅠ、AsiaⅡ1、AsiaⅡ3、MED、MEAM1隐种)以及桑粉虱、螺旋粉虱、黑刺粉虱、柑橘粉虱、双钩巢粉虱和温室粉虱等不具有交叉反应和扩增能力。灵敏性检验结果显示，该对引物不仅对不同性别、不同采集地的成虫具有良好的扩增效能，对2～4龄若虫以及单粒卵和初孵若虫亦具有同样的扩增效力，其最低检测阈值为75.1 pg·μL-1(相当于1/10240头雌性成虫)。【结论】该技术体系可用于梣粉虱的快速准确鉴定及其检测和监测，对有效阻截其进一步传播扩散具有重要作用。

梣粉虱；种特异性引物；检测阈值；快速鉴定；分子检测；监测

梣粉虱Siphoninus phillyreae(Haliday)，属半翅目粉虱科虹管粉虱属，是一种世界性检疫性害虫(Martin，1987)，2002年我国台湾将其列为重要的防疫检疫性害虫(柯俊成和许洞庆，2004)，2006年中国国家质量监督检验检疫总局将其列为需要关注的进境检疫性有害生物(详见国质检动[2006]31号文件)。梣粉虱为多食性害虫，寄主植物多达11科28属60多种/变种，且以果树和园林植物为主，如蔷薇科、石榴科、芸香科、鼠李科、豆科、夹竹桃科、紫葳科、木兰科、木犀科、茜草科及千屈菜科等，尤其嗜好蔷薇科和木犀科的植物(Dooley，2009；Stocks＆Hodges，2000)。其中，受害较为严重的果树植物有蔷薇科的桃、杏、苹果、梨、山楂、木瓜，石榴科的石榴，以及芸香科的金橘、橘子、橙子、柠檬等；园林植物受害较重的有蔷薇科的樱花、海棠、榆叶梅，木犀科的梣树、女贞、丁香，紫葳科的楸树，千屈菜科的紫薇，茜草科的风箱树，以及木兰科的郁金香树等(Byrne，1991； Martin et al.，2000)。 在非洲北部、地中海地区以及南美洲和欧洲等地区，梣粉虱还可以危害重要的油料兼果用植物——油橄榄 Olea europaea L.(Gómez-del-Campo et al.，2010；Nguyen＆Hamon，2014)。梣粉虱原产于欧洲、地中海和非洲北部地区，寄主范围广，适生能力强(Paula et al.，1995)，极易随植物苗木的贸易活动进行远距离传播扩散，一旦在新入侵区域成功定殖，就会导致数百万美元的经济损失(Tom et al.，1992)。目前，梣粉虱已扩散至北美洲的美国、墨西哥，南美洲的秘鲁、委内瑞拉，以及亚洲的以色列、叙利亚、印度、巴基斯坦、日本等多个国家和地区(冼晓青等，2015； CABI，2014)。

粉虱类害虫是我国入侵事件发生最为频繁的外来入侵生物类群之一，自2003年发现烟粉虱MED隐种Bemisia tabaci(Gennadius)(Q型)入侵以来(褚栋等，2005)，已先后有螺旋粉虱Aleurodicus disperses(Russell)(虞国跃等，2007)、双钩巢粉虱Paraleyrodes pseudonaranjae Martin(虞国跃等，2010)、小巢粉虱Paraleyrodes minei Iaccarino(虞国跃等，2014；朱文静和符悦冠，2013)、甘蓝粉虱Aleyrodes proletella(L.)(张桂芬等，2014)等多种粉虱类害虫入侵中国大陆，同时，园林和果树重大害虫梣粉虱也不请自来(冼晓青等，2015)，对我国果树以及园林绿化产业构成了严重威胁。通常，粉虱类害虫的鉴定主要依据拟蛹的外部形态特征，或雄性成虫的外生殖器特征，如双钩巢粉虱(虞国跃等，2010；Martin，2001)。 然而，梣粉虱个体微小，成虫体长0.80～1.10 mm，含翅体长约为1.40 mm(Stocks＆Hodges，2000)，且与其他粉虱类昆虫间的形态非常相似。因此，未经过专业训练的非粉虱分类人员很难对其进行准确鉴定。为此，本研究拟以线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ (mitochondrial DNA cytochrome c oxidase submitⅠ， mtDNA COⅠ)基因为靶标，建立靶向梣粉虱的种特异性(speciesspecific COⅠ，SS-COⅠ)PCR检测技术体系，以期为有效阻截梣粉虱的进一步传播扩散，实时监测其种群扩张趋势及对其有效防控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

梣粉虱采自上海闵行区和江苏南京玄武区，寄主植物均为石榴树。本研究涉及到的其他种/隐种粉虱共计11种:烟粉虱MED隐种(Q型)、MEAM1隐种(B型)以及温室粉虱Trialeurodes vaporariorum(Westwood)均饲养在中国农业科学院植物保护研究所温室，寄主植物分别为番茄和棉花；烟粉虱AsiaⅠ隐种和AsiaⅡ1隐种(ZHJ-2型)由浙江大学赠送，AsiaⅡ3隐种(ZHJ-1型)由华南农业大学赠送；桑粉虱Bemisia myricae Kuwana和柑橘粉虱Dialeurodes citri(Ashmead)均采自中国农业科学院院内花园，寄主植物分别为紫椹果桑树和月季；螺旋粉虱和双钩巢粉虱均采自海南省海口市，寄主植物分别为番石榴和小叶榕；黑刺粉虱Aleurocanthus spiniferus(Quaintance)采自湖北省荆州市，寄主植物为柑橘。

1.2 DNA提取

以梣粉虱以及其他11种/隐种粉虱为靶标，参照李小凤等(2014)的方法，提取单头粉虱总DNA。提取的DNA以40μL超纯水复溶，以超微量分光光度计(NanoPhotometerTM P330， Implen， Munich，Germany)测定浓度，-40℃保存备用。

1.3 粉虱类昆虫COⅠ基因序列的PCR扩增

以梣粉虱以及其他11种/隐种粉虱DNA为模板，以mtDNA COⅠ基因的通用型引物对LCO1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和 HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′) 进行扩增，片段长度约为700 bp(Folmer et al.，1994)。PCR 反应体系为30 μL，其中，10× Buffer(含Mg2＋)2.5 μL，dNTPs(10 mmol·L-1)0.5 μL，上游引物和下游引物(5 pmol·L-1)分别为0.5μL，Taq DNA聚合酶(2.5 U·μL-1，北京全式金生物技术有限公司)0.4μL，模板DNA 1.0μL，以24.6μL超纯水补齐。扩增程序为95℃预变性2 min；35个循环:94℃40 s，52℃ 40 s，72℃ 40 s；最后72℃延伸5 min。PCR扩增反应在基因扩增仪(ABI-9700)上运行。取4μL PCR产物在含有GoldView的1.0%(w/v)琼脂糖凝胶上以90 V电泳(Bio-Rad Power-Pac Basic)分离45 min后，检测电泳结果。

1.4 梣粉虱的种特异性SS-COⅠ引物对的设计

将1.3中检测合格的PCR产物进行双向测序(北京三博远志生物技术有限公司)，然后根据测序结果以软件Oligo 6.0设计1对靶向梣粉虱COⅠ基因的种特异性SS-COⅠ引物对，并命名为SPZWCF1/SPZWCR1。上游引物SPZWCF1的碱基序列为5′-AAGAGAATTAAGTAATAGAGGG-3′， 下 游 引 物SPZWCR1的碱基序列为 5′-GATTCAAATCTTATACCCAATAGT-3′；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 梣粉虱SS-COⅠ引物对的特异性检验

分别以单头不同隐种的烟粉虱(包括AsiaⅠ、AsiaⅡ1、AsiaⅡ3、MED 和 MEAM1隐种)以及桑粉虱、螺旋粉虱、黑刺粉虱、柑橘粉虱、双钩巢粉虱和温室粉虱的DNA为模板，以梣粉虱为阳性对照，验证梣粉虱特异片段扩增引物对SPZWCF1/SPZWCR1的物种特异性。反应体系为25μL，其中，10× Buffer 2.5μL，dNTPs 0.2μL，上游引物和下游引物分别为0.2μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，模板DNA 1.0μL，以20.7μL超纯水补齐。反应条件为94℃预变性2 min；30个循环:94℃ 30 s，50℃30 s，72℃ 30 s；最后72℃延伸5 min。扩增产物的检测方法同1.3。每种/隐种粉虱各检测8头。

1.6 梣粉虱SS-COⅠ引物对的灵敏性检测

以不同性别(单头雌性成虫和雄性成虫)、不同虫态(单粒卵，单头1、2、3、4龄若虫和拟蛹)和不同采集地(上海和江苏)的梣粉虱DNA，以及2倍递减稀释(19.2×103、9.6×103、4.8×103、2.4×103、1.2×103、0.6×103、0.3×103、150.2、75.1、37.55、18.78、9.39、4.69、2.35 和 1.17 pg·μL-1，相当于 1/40、1/80、1/160、1/320、1/640、1/1280、1/2560、1/5120、1/10240、 1/20480、 1/40960、 1/81920、 1/163840、1/327680和1/655360头)的单头成虫(雌性)DNA为模板，进行灵敏性检测。每个性别、每个虫态、每个地区以及每个浓度各检测8头。

2 结果与分析

2.1 粉虱类害虫COⅠ基因碱基序列扩增及种特异性标记分析

电泳检测结果表明，12种/隐种粉虱都能扩增出一条清晰明亮的目的片段(图1)。将电泳检验合格的PCR产物进行双向测序，结果表明该片段的长度大约为710 bp(梣粉虱GenBank登录号为HFS.2012.201199.5.1)。根据碱基序列测定结果设计梣粉虱特异性 SS-COⅠ引物1对(SPZWCF1/SPZWCR1)，其扩增片段的大小为426 bp。

2.2 梣粉虱SS-COⅠ引物的种特异性验证

电泳检测结果表明，种特异性引物SPZWCF1/SPZWCR1只对梣粉虱具有扩增效果，对其他田间常见的11种/隐种粉虱不具有扩增能力，说明该对引物为梣粉虱的特异性引物(图2)。

2.3 种特异性SS-COⅠ引物对不同性别、虫态和地域梣粉虱的扩增效果

以不同性别、虫态以及采自2个地域的梣粉虱DNA为模板，采用种特异性引物对 SPZWCF1/SPZWCR1进行PCR扩增。检测结果表明，不同性别、不同虫态以及2个地域的梣粉虱均能扩增出426 bp的特异性片段(图3)。

图1 COⅠ基因通用型引物LCO1490/HCO2198对梣粉虱及其他11种/隐种田间常见粉虱DNA的扩增效果Fig.1 PCR amplification of mitochondrial DNA of S.phillyreae and 11 other whitefly species or cryptic species common in the field using a pair of universal primer pair LCO1490/HCO2198 target to COⅠgene

图2 种特异性SS-COⅠ引物SPZWCF1/SPZWCR1对梣粉虱以及其他11种/隐种田间常见粉虱类害虫的扩增效果Fig.2 Amplification pattern of mitochondrial DNA of S.phillyreae and 11 other whitefly species or cryptic species using the species-specific SS-COⅠprimer pair SPZWCF1/SPZWCR1

2.4 梣粉虱特异性SS-COⅠ引物的检测阈值

将单头梣粉虱成虫(雌性)的DNA模板以2倍递减稀释，检测结果显示，所有的个体都可以扩增出特异性的目的条带。当浓度为2.35～37.55 pg·μL-1时，依然有20%～50%的个体能扩增出较弱的目的片段(图4)，表明该引物对的灵敏性较高，检测阈值大约为75.1 pg·μL-1(即1/10240头成虫)。

3 讨论

我国是遭受外来入侵生物危害最为严重的国家之一。梣粉虱于2002年首次在中国台湾发生危害(柯俊成和许洞庆，2004)；2010年在上海被发现为害蔷薇科的梨树，2年后又被发现其为害石榴科的石榴树、木犀科的桂花树等(史苹香，2012；冼晓青等，2015)；2015年笔者又在江苏省发现其踪迹。目前，梣粉虱只在我国局部区域发生危害，一旦进一步传播扩散，必将对我国的园林绿化行业、水果产业以及饮料行业等造成巨大经济损失。

图3 种特异性SS-COⅠ引物SPZWCF1/SPZWCR1对不同虫态、不同性别和2个地域梣粉虱的PCR扩增效果Fig.3 Amplification pattern of mitochondrial DNA from different developmental stages，sexes and adults collected in two locations of S.phillyreae using the SS-COⅠprimer pair SPZWCF1/SPZWCR1

图4 种特异性SS-COⅠ引物SPZWCF1/SPZWCR1对梣粉虱线粒体DNA的检测阈值Fig.4 Detection threshold for diluted mitochondrial DNA samples of female adults of S.phillyreae using SS-COⅠprimer pair SPZWCF1/SPZWCR1

本研究采用基于mtDNA COⅠ基因的物种特异性SS-COⅠ标记方法，研发出了靶向梣粉虱的特异性引物对SPZWCF1/SPZWCR1及其快速检测技术。该对引物只对梣粉虱的目的基因片段具有扩增能力，对田间常见的其他11种/隐种粉虱(包括烟粉虱AsiaⅠ隐种、AsiaⅡ1隐种、AsiaⅡ3隐种、MED隐种和MEAM1隐种，以及桑粉虱、螺旋粉虱、黑刺粉虱、柑橘粉虱、双钩巢粉虱和温室粉虱)不具有扩增效果。同时，该技术体系具有比较高的灵敏度，不仅对梣粉虱成虫(包括雌性和雄性)、2～4龄若虫和拟蛹具有好的扩增效果，对单粒卵和初孵若虫亦具有同样的扩增能力，其检测阈值约为75.1 pg·μL-1，相当于1/10240头雌性成虫。进一步的数据库同源性比对分析结果表明，没有任何一种近缘种粉虱或其他昆虫的DNA序列与梣粉虱特有的426 bp片段完全一致(碱基序列一致性≤82%)，表明该检测技术体系可以用于口岸园林植物及果树苗木等国际贸易活动的检验检疫，以及国内地区间种苗的调运检疫及其种群扩张趋势的监测。

基于mtDNA COⅠ基因的序列测定以及据此发展起来的物种特异性SS-COⅠ标记技术，是目前用于鉴定外来入侵粉虱类害虫的最为常用的方法之一。如罗晨等(2002)和Qiu et al.(2009)以COⅠ基因3′端为靶标，采用DNA序列测定法成功鉴定了B型(MEAM1隐种)、Q型(MED隐种)和 Cv型(AsiaⅡ 7隐种)烟粉虱；Ovalle et al.(2014)以COⅠ基因5′端序列为靶标，鉴定了在哥伦比亚发生的9种重要的粉虱科害虫[包括螺旋粉虱、Aleuronudus melzeri Bondar、丝 绒 粉 虱 Aleurothrixus floccosus Maskell、Aleurotrachelus socialis Bondar、 辣 椒 粉 虱Aleurotrachelus trachoides Back、烟粉虱、Lecanoideus floccissimus Martin、温室粉虱和木瓜粉虱Trialeurodes variabilis(Quaintance)等]，并表明研究结果对上述粉虱类害虫捕食性天敌的保护利用意义非凡；李小凤等(2014)则分别以 COⅠ基因5′端和 3′端为靶标，对包括烟粉虱MED隐种、双钩巢粉虱、螺旋粉虱等入侵种在内的我国田间常见的16种粉虱进行了分子鉴定，并指出5′端序列更适用于基于DNA条形码技术的物种鉴定；陈苗苗等(2015)和张桂芬等(2013)基于COⅠ基因序列，采用SS-COⅠ标记技术，分别建立了入侵种甘蓝粉虱和双钩巢粉虱的快速检测技术体系。

准确、快速、高效的物种鉴定方法对实时掌控梣粉虱在我国的扩张动态，制定行之有效的靶向性防控策略具有重要指导意义。本研究研发建立的梣粉虱特异性SS-COⅠ引物对SPZWCF1/SPZWCR1及其快速检测技术体系，弥补了基于外部形态特征鉴定法的不足，不仅准确性高、灵敏度强，而且操作简便、快捷有效，在梣粉虱种群扩张趋势实时监测和有效阻截与防控中将发挥重要作用。然而需要注意的是，粉虱类害虫种类比较多，其中有些常见种类在本研究中并未涉及，如分布于欧洲可对柑橘造成危害的Siphoninus immaculatus(Heeger)。因此，该对SS-PCR引物的特异性还需要进一步考证。

致谢:浙江大学昆虫科学研究所刘银泉教授提供烟粉虱AsiaⅠ隐种和AsiaⅡ1隐种标本，华南农业大学资源环境学院邱宝利教授提供烟粉虱AsiaⅡ3隐种标本，特表感谢。

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Species-specific COⅠprimers for rapid identification of an exotic whitefly，Siphoninus phillyreae(Haliday)

ZHANG Guifen1，2∗， WANG Yusheng1， XIAN Xiaoqing1，2， WAN Fanghao1，2， SHAO Jiawen3

1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China；2Center for Management of Invasive Alien Species， Ministry of Agriculture， Beijing 100193，China；3College of Agronomy and Plant Protection， Qingdao Agricultural University， Qingdao， Shandong 266109， China

【Aim】 The ash whitefly Siphoninus phillyreae(Haliday)，is one of the most important pests infesting fruit trees and ornamental plants worldwide.It is a recent invader to China.Morphological identification of this whitefly is complicated by its small size， high degree of similarity to related whitefly species and polymorphism.In the present study， a species-specific identification technique based on mitochondrial DNA cytochrome Coxidase subunitⅠ (mtDNA COⅠ)gene sequence(namely SS-COⅠ marker)was developed for the rapid identification of S.phillyreae.【Method】 The fragments of mtDNA COⅠ gene of S.phillyreae and 11 other related whitefly species or cryptic species were amplified and sequenced using COⅠgene universal primers LCO-1490/HCO-2198.One pair of species-specific COⅠ (SS-COⅠ)primers， SPZWCF1 and SPZWCR1 was designed.The length of target fragment amplified by this SS-COⅠprimer pair was identified and its specificity and sensitivity tested using various life stages and sexes of 11 whitefly species collected from two geographic locations.【Result】 The primer pair amplified a 426 bp long fragment.The primer pair proved species-specific as it gave no cross-reactions against any of the 11 other whitefly species tested:five cryptic species of Bemisia tabaci(Gennadius)(AsiaⅠ，AsiaⅡ1， AsiaⅡ3， MED and MEAM1)， Bemisia myricae Kuwana， Aleurodicus disperses(Russell)，Aleurocanthus spiniferus Quaintance，Dialeurodes citri(Ashmead)，Paraleyrodes pseudonaranjae Martin and Trialeurodes vap-orariorum(Westwood).All S.phillyreae specimens were successfully identified.Sensitivity test demonstrated that the successful amplification could be obtained with 75.1 pg·μL-1template DNA，equal to 1/10240 of a whole female S.phillyreae adult.【Conclusion】 The SS-COⅠ method developed here provides a rapid， simple and reliable molecular technique for the identification and monitoring of S.phillyreae，which would be benefit in intercepting and blocking the further spreading of this new invasive whitefly species.

Siphoninus phillyreae； SS-COⅠ primers； detection threshold； rapid identification； molecular detection； monitoring

10.3969/j.issn.2095-1787.2017.04.003

2017-07-11 接受日期(Accepted):2017-09-11

国家重点研发计划(2017YFC1200600、2016YFC1200600)；公益性行业(农业)科研专项(201303019、201103026)；农业部“一带一路”948项目(2016-X48)

张桂芬，女，研究员，博士。研究方向:入侵生物预防与控制

∗通信作者(Author for correspondence)，E-mail:guifenzhang3＠163.com

(责任编辑:杨郁霞)