西花蓟马蛋白的提取及双向电泳体系的建立

王金鑫，杨 爽，张鑫鑫，张炬红，席景会，王 军

吉林大学植物科学学院，吉林长春130062

西花蓟马蛋白的提取及双向电泳体系的建立

王金鑫，杨 爽，张鑫鑫，张炬红，席景会，王 军∗

吉林大学植物科学学院，吉林长春130062

【目的】蛋白样品的制备是获得良好双向凝胶电泳(2-DE)图谱的前提，建立合理的西花蓟马蛋白的双向电泳体系，获得分辨率较高、重复性较好的图谱，能够为后续的研究提供有力支撑。【方法】实验以西花蓟马成虫为实验材料，对比了饱和酚法、TCA/丙酮法和直接裂解法3种蛋白提取方法，从中选出最适宜双向电泳分析的一种蛋白提取方法。【结果】3种方法蛋白提取率差异显著，直接裂解法蛋白提取率最高，饱和酚法的蛋白提取率最低；3种方法的SDS-PAGE条带数差异不明显；TCA/丙酮法的双向凝胶图谱效果最好，蛋白点最多。【结论】TCA/丙酮法能够有效去除西花蓟马蛋白中的干扰物质，是最适合西花蓟马双向凝胶电泳的蛋白提取方法，为后续西花蓟马在蛋白组学方面的研究奠定了基础。

西花蓟马；双向凝胶电泳；蛋白质组学；蛋白提取

蛋白质组学分析是后基因组时代的重要技术手段(黎飞，2010)，蛋白质双向电泳(two-di-mensional electrophoresis，2-DE)是蛋白质组学研究的重要技术之一(Wang et al.，2008)。尽管蛋白质组学研究的技术进展比较迅速，2-DE仍然是进行复杂蛋白质样品分离的核心技术，蛋白质样品的制备是2-DE的关键，也是进行后续蛋白质组学研究的前提(刘倩等，2010)。

西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande)又称苜蓿蓟马，属缨翅目 Thysanoptera蓟马科Thripidae，是一种危害性严重的外来入侵物种，寄主种类多(张安盛等，2012；周卫川等，2006)。随着国际贸易往来的日趋频繁，该虫随花卉和蔬菜的远距离运输迅速向世界各地扩散(张桂芬，2014)。为从蛋白层面上揭示西花蓟马的入侵机制，建立适用于蛋白质双向电泳分析的蓟马全蛋白提取方法十分必要。蓟马蛋白质含量相对较低，成份复杂，富含核酸、脂类及多糖等干扰物质，这些物质给蛋白质的定量和分析带来了困难。加之一些几丁质、肌动蛋白、骨骼蛋白等不易溶解，使得蓟马的蛋白提取比较困难。本实验以西花蓟马成虫为材料，对不同的蛋白质提取方法进行了比较研究，为蓟马蛋白质样品的制备提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

西花蓟马采于吉林大学校园的万寿菊中，将其饲养于养虫室自然条件下生长的地被菊上，温度控制在(25±2)℃、相对湿度40%～50%、光周期L∶D＝16 h∶8 h。收集成虫作为试虫，采集后分装于离心管中，冻于-80℃冰箱中备用。

1.2 蛋白的提取

1.2.1 饱和酚法 参考Faurobert et al.(2007)的方法，取-80℃冻存的成虫样品，置于液氮中充分研磨，分别加入1 mL-20℃预冷的10%TCA/丙酮溶液、甲醇和80%的丙酮溶液，充分悬浮后，于4℃、15000 r·min-1的条件下各自离心洗涤5 min，弃上清，得到的沉淀于室温下干燥2 min；加入等体积的饱和酚溶液和dense SDS buffer(0.1 mol·L-1pH 8.0 Tris-HCl、2%SDS、2%β-巯基乙醇、30%蔗糖)，充分混匀震荡，于 4 ℃、15000 r·min-1离心5 min，取酚层加入5倍体积的0.1 mol·L-1乙酸铵溶液，于-20 ℃ 下沉淀 2 h；4 ℃、15000 r·min-1离心15 min，沉淀用80%丙酮洗涤2～3次，将沉淀于室温下干燥后，置于-80℃冰箱中储存备用。

1.2.2 TCA/丙酮法 参考Méchin et al.(2007)的方法，取-80℃冻存的成虫样品，置于液氮中充分研磨，加入1 mL-20℃预冷的10%TCA/丙酮，充分震荡混匀，于-20℃冷藏 2 h以上；4℃、15000 r·min-1离心 15 min，弃上清；沉淀用 1 mL冷丙酮充分悬浮，-20℃冷藏 30 min；4℃、15000 r·min-1离心 5 min，弃上清；沉淀用 1 mL 80%冷丙酮充分悬浮，-20℃冷藏30 min；4℃、15000 r·min-1离心 5 min，弃上清；将沉淀干燥2 min，蛋白沉淀置于-80℃冰箱中储存备用。

1.2.3 直接裂解法 参考Nguyen et al.(2007)的方法，取-80℃冻存的成虫样品，置于液氮中充分研磨，加入适量4℃预冷的裂解液，充分震荡混匀，4℃、12000 r·min-1离心 15 min，取上清，4 ℃、15000 r·min-1离心 40 min，取上清，样品冻于-80℃冰箱中储存备用。

1.3 蛋白浓度的测定

取-80℃冻存的蛋白样品，根据样品的量加入适量的 lysis buffer充分涡旋，30℃孵育 1.5 h，20℃、13000 r·min-1离心30 min，取上清进行蛋白浓度测定。

参照Bradford(1976)法测定蛋白质浓度，以牛血清白蛋白为标准蛋白。

1.4 SDS-PAGE凝胶电泳

分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为4%。采用考马斯亮蓝染色法进行染色。染色后的凝胶用Epson Expression 10000XL扫描仪扫描。利用Image J软件进行图像分析。

1.5 双向凝胶电泳

取300μg蛋白溶液于离心管中，加入6.8μL IPG buffer，加入lysis buffer至340μL充分震荡混匀，将18 cm pH 3～10的IPG胶条覆盖于该溶液上方，在水化槽中水化16 h以上。在等电聚焦仪中进行第一向等电聚焦。在胶条平衡缓冲液(6 mol·L-1尿素、2%SDS、30%甘油、50 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.8、0.002%溴酚蓝)中分别加入1%DTT和2.5%碘乙酰胺溶液，使用摇床震荡15 min进行胶条平衡后将胶条转移至聚丙烯酰胺凝胶中进行第二向垂直电泳。使用银染方法进行凝胶染色(Yan et al.，2000)。染色后用Epson Expression 10000 XL扫描仪扫描，利用ImageMasterTM 2D Platinum 7.0软件进行图像分析，每种提取方法重复2次。

2 结果与分析

2.1 蛋白产率分析

3种方法提取的蛋白产率利用Sigma软件制作图，结果如图1所示，直接裂解法的平均蛋白提取率最高，为57.9 μg·mg-1，TCA/丙酮法为 46.2 μg·mg-1，饱和酚法为22.6μg·mg-1。通过instat软件对其进行显著性差异分析，其中TCA/丙酮法与饱和酚法和直接裂解法差异性不显著(p＞0.05)，饱和酚法与直接裂解法具有显著性差异(p＜0.05)。

2.2 SDS-PAGE图谱分析

将3种方法提取的蛋白以相同的上样量进行SDS-PAGE电泳检测，结果显示，3种方法的条带数目差异不明显。直接裂解法条带最多，为31条，但蛋白条带不明显；饱和酚法30条，TCA/丙酮法28条，条带最为清晰明显。蛋白分布差异不大，主要集中于25.0 ku以上和14.4～18.4 ku之间(图2)。

图1 3种方法提取蛋白质的产率Fig.1 The rate of protein extraction from the three methods

图2 3种方法提取西花蓟马总蛋白的SDS-PAGE电泳Fig.2 SDS-PAGE analysis of F.occidentalis using three protein extraction methods

2.3 双向电泳图谱分析

TCA/丙酮法、饱和酚法和直接裂解法提取总蛋白的双向图谱如图3所示。相对于直接裂解法，饱和酚法和TCA/丙酮法得到的蛋白纯度较高，杂质较少，能够得到背景相对清晰的图谱。直接裂解法由于蛋白纯度较低，杂质较多，得到的图谱整体背景不清晰，蛋白点最少且形状不规则，在45.0 ku和25.0 ku处有明显弥散现象。

TCA/丙酮法、饱和酚法和直接裂解法分别得到平均429、330和235个蛋白点。TCA/丙酮法蛋白点最多，蛋白点颜色层次分明，蛋白点形状规则；饱和酚法图谱背景较清晰，蛋白点形状规整，但蛋白点颜色普遍较浅，蛋白点较TCA/丙酮法少。3种方法提取的蛋白点分子质量大小主要集中在40 ku以下，酸性蛋白点略比碱性蛋白点多(图4)。

3 讨论

蛋白质样品的制备是进行2-DE的关键步骤，也是进行昆虫蛋白质组学研究的前提(Gygi et al.，2000)。由于昆虫组织中所含有的色素、几丁质、醌类及其他多种代谢产物的干扰，获得重复性好的2-DE图谱相对比较困难(Liao et al.，2016)。本研究比较了3种不同蛋白提取方法对西花蓟马2-DE结果的影响，以寻找一种适用于西花蓟马等蓟马类成虫的双向电泳方法，为后续蓟马类蛋白质组分析奠定一定的基础。

本实验采用的3种蛋白提取方法，在蛋白提取率上存在明显差异，直接加入lysis buffer的直接裂解法步骤简单，可以避免沉淀造成的蛋白损失(Carpentier et al.，2005； Laville et al.，2009)。 它的原理是将可溶性蛋白溶解在裂解液中，能够有效减少蛋白的降解。由于lysis buffer中含有高浓度的尿素和硫脲，二者联合发挥协同作用，可以增强溶解疏水性蛋白效应，因此蛋白产率较高。直接裂解法得到的SDS-PAGE图谱上的条带较为模糊，蛋白样品中含有杂质较多。样品中盐离子的浓度也会影响2-DE的效果。盐离子增加胶条的导电性并引起电内渗，进而干扰蛋白质的等电聚焦，导致聚焦不完全，从而在双向电泳图谱产生水平条纹(刘倩等，2010)。直接裂解法没有洗涤样品的步骤，杂质和盐分含量较高，更多的脂质和核酸会干扰蛋白质的聚焦和分离(Canas，2007； Lee，2010)。 直接裂解法制备的蛋白在等点聚焦过程中，电压上升慢，耗时长，2-DE图谱背景不清晰，蛋白点少，出现多处横条纹。

图3 不同蛋白提取方法的2-DE凝胶图谱Fig.3 2-DE analyses of proteins from the three extraction methods

图4 不同蛋白提取方法分析Fig.4 Analysis of different protein extraction methods

酚是强的蛋白变性剂，可以使细胞或组织中的蛋白质变性析出。在提取时，蛋白能很好地溶于酚层，而核酸和一些小分子物质溶于水相而被清除(付涵予等，2011)。饱和酚法得到的图谱背景清晰，在等点聚焦过程中电压升得快，耗时短，但该方法的蛋白提取率较低，操作相对繁琐，出现少量横条纹。

大部分蛋白可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质可溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中(杨爽等，2016)。TCA/丙酮法能有效去除蛋白质中的杂质，是一种广泛应用的蛋白提取方法(Hao et al.，2015)。丙酮通过有机溶剂破坏蛋白质的水化层，降低介电常数，增强带电蛋白质分子的相互作用，促进蛋白的聚集沉淀；同时作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团，使之聚集沉淀(Görg et al.，2004)。TCA/丙酮法可以很好地去除西花蓟马成虫蛋白中的干扰物质，其2-DE图谱背景清晰，蛋白点较多且清晰，形状规则。无论从图谱清晰度还是从蛋白分布情况来看，TCA/丙酮法都是适合西花蓟马蛋白提取的方法。

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Protein extraction of Frankliniella occidentalis and establishment of two-dimensional electrophoresis system

WANG Jinxin， YANG Shuang， ZHANG Xinxin， ZHANG Juhong， XI Jinghui， WANG Jun∗
College of Plant Science， Jilin University， Changchun， Jilin 130062， China

【Aim】Protein sample preparation is the prerequisite to obtain an optimal two-dimensional electrophoresis(2-DE)gel map.Establishing a suitable 2-DE system can provide a strong support for the subsequent research.【Method】 This study used Frankliniella occidentalis adults as experimental materials， and compared three protein extraction methods:Tris-phenol， TCA/acetone precipitation，and direct decomposition extraction.The most suitable method of 2-DE system was defined through the analysis of 2-DE protein images.【Result】 Experimental results revealed that the three methods showed significant differences in protein extraction rate，among which the direct decomposition method was the highest while Tris-phenol method was the lowest.The three methods got similar SDS-PAGE results.TCA/acetone method had the best quality of 2-DE gel map，with the highest number of protein spots.【Conclusion】 The results suggest that TCA/acetone method could remove interfering substance effectively and was optimal for protein extraction of F.Occidentalis.It laid foundation of further study on the proteomics of F.occidentalis.

Frankliniella occidentalis； 2-DE； proteomics； protein extraction

10.3969/j.issn.2095-1787.2017.04.004

2017-06-21 接受日期(Accepted):2017-08-15

国家自然科学基金项目(31201576)；吉林省科技发展计划项目(20150309006NY、20160520035JH)

王金鑫，女，硕士研究生。研究方向:昆虫分子生物学。E-mail:jxwang16＠mails.jlu.edu.cn

∗通信作者(Author for correspondence)， E-mail:wang＿jun＠jlu.edu.cn

(责任编辑:郭莹)