迷迭香提取物对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

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1.昆明医科大学，云南 昆明 650500；2.江西省余干县人民医院，江西 余干 335100；3.贵州医科大学，贵州 贵阳 550004

实验研究

迷迭香提取物对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

张兰春1程先睿2于浩飞1胡炜彦1高秀丽3张荣平1*

1.昆明医科大学，云南 昆明 650500；2.江西省余干县人民医院，江西 余干 335100；3.贵州医科大学，贵州 贵阳 550004

目的研究迷迭香提取物(MDX 60)对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法将50只健康SD大鼠，随机分为5组，模型组，迷迭香提取物(MDX 60)和灯盏花素提取物(EBHM)的高(680mg/kg·d)、低(170mg/kg·d)剂量组，每组10只，其中EBHM为阳性对照组。分别对各组大鼠冠状动脉左前降支(LAD)进行结扎，以心尖处变为苍白色为缺血成功的标志，40min后剪掉结扎线，再灌注120min，进而制备心肌缺血再灌注损伤模型。造模成功后，采用1%红四氮唑(TTC)染色测量大鼠心肌梗死面积，用Image-Pro Plus图像处理软件测定大鼠心肌缺血面积的改变。结果与模型组比较，MDX 60(17mg/kg、68mg/kg)和EBHM(170mg/kg、680mg/kg)的缺血面积百分比明显缩小(Plt;0.01)；MDX 60低剂量组与EBHM低剂量组的缺血面积百分比相近，MDX 60高剂量组和EBHM高剂量组相比缺血面积有所增大。结论MDX60可以通过减小心肌梗死面积，发挥对大鼠心肌缺血再灌注损伤的护作用，低剂量MDX 60比EBHM对大鼠心肌梗死面积发挥更好的保护效果。

迷迭香提取物；心肌缺血再灌注；梗死面积；保护

随着科技、经济的发展，人们生活节奏的加快和生活水平的不断提高，心脑血管疾病的发病率也随之不断上升、其致死率已超过恶性肿瘤，成为全世界范围内危害人类健康生命的头号杀手。心肌缺血再灌注损伤(Myocardial Ischemia Reperfusion Injury，MIRI)是缺血的心肌在恢复血流后损伤反而加重的现象，与氧化应激、钙离子超载、炎症反应、细胞凋亡密切相关，主要表现为心肌细胞水肿、再灌注性心律失常、心肌抑顿、微血管的损伤、心肌细胞的死亡[1]。近年来，探索中医药在保护缺血心肌再灌注损伤中发挥的作用已成为研究的热点。唇形科迷迭香属植物迷迭香(RosmarinusofficinalisL.) 是一种具有丰富使用价值的植物，其化学成分鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酚、熊果酸、迷迭香酸等，具有延缓衰老、防腐、抗菌、抗氧化等功效[2]。研究表明，迷迭香中的鼠尾草酸作为小分子亲电性化合物，抗氧化的作用机制主要表现在清除自由基，切断类脂氧化的链式反应，影响内源性氧化系统等方面[3]，迷迭香酸通过提高氧化酶活性、增强清除自由基能力以及抑制心肌缺血后心肌细胞凋亡的发生进而对大鼠冠脉结扎后引起的心肌缺血损伤的起保护作用[4]。本研究拟在大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的基础上，观察迷迭香提取物对心肌梗死范围的影响，探讨迷迭香提取物对大鼠心肌缺血再灌住损伤的保护作用，为下一步开展研究提供基础与依据。

1 仪器与材料

1.1 药品与试剂 迷迭香提取物(批号：SP141101)为黄色，粉末状，主要成分是鼠尾草酸(60%)；阳性对照药灯盏花素(EBHM，批号：S141201-2)为淡黄色，粉末状，主要成分是灯盏花素(20.24%)；2个样品均由昆明医科大学药物化学教研室提供。氯化三苯基四氮唑(TTC，批号：101060270，美国Sigma公司)；生理盐水(浙江国镜药业，批号：c150927)；10%乌拉坦注射液(自配)；4%甲醛溶液(重庆茂业，批号：20161016)。

1.2 动物 健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，体质量(200±20)g，雌雄各半，由昆明医科大学实验动物学部提供，SPF级，动物合格证号: SCXK(滇)2015-0002。

1.3 仪器 ALC-V9动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司)；SHA-B水浴恒温振荡器(上海比朗仪器有限公司)；WZ-50C6微量注射泵(浙江史密斯医学仪器有限公司)；ES-1000E电子天平(湘仪天平仪器设备有限公司)；手术器械若干。

2 方法

2.1 分组及给药 将60只健康SD大鼠随机分为6组，正常组，模型组，灯盏花素提取物(EBHM)和 MDX 60 2种药物的低(170mg/kg·d)、高(680mg/kg·d)剂量组，每组10只，雌雄各半，其中EBHM为阳性对照组。对各组动物分别进行标记，术前3d灌胃给药(2mL/100g)，正常组和模型组给予生理盐水，其余各组按相应的剂量分别给以灌胃，每天给药1次，第4天给药之后立即手术。

2.2 动物模型 参照徐叔云等[5]报道的方法复制大鼠心肌缺血再灌注损伤模型：腹腔注射10%乌拉坦(1mL/100g)对大鼠实施麻醉，后仰卧位固定，四肢皮下插入针形电极，采用18g、38mm笔筒型动静脉留置针经口插入大鼠气管中，行气管插管，连接小动物呼吸机进行人工呼吸(呼吸频率73次/min，呼吸比1∶1，潮气量11cc)。待呼吸稳定后，去除胸部的毛，沿胸骨左缘剪开皮肤，钝性分离肌肉，剪断第3、4肋骨，暴露胸腔后，小心剪开心包膜，暴露心脏，以左心耳肺动脉圆锥交界处的左冠状静脉为标志，对胸腺进行固定，在左心耳下缘1～2mm处与肺动脉圆锥间穿5-0号缝合线，取一小段直径约为1～1.5mm的线压在结扎部位之上，后拉紧丝线，形成心肌缺血，心尖处变为苍白色为缺血成功标志。40min后开胸剪去结扎线再灌注120min。

2.3 测定心肌梗死面积 打开胸腔取出心脏，置于预冷的生理盐水中洗去血渍，置于电子天平上称取全心重后去除心房、右心室及筋膜组织，将左心室用滤纸吸取水分后称重。将心脏置于-20℃冰箱中5min以便于切片，取出后用自制刀片沿横切面将心脏均匀切成厚度1mm薄片。心脏切片放入37℃预热过的1%TTC溶液中，在37℃下用水浴恒温振荡器振荡染色10～15min，4%甲醛溶液固定，观察染色结果，非梗死心肌组织为红色，缺血坏死心肌组织为苍白色。将染色的心脏切片置于生理盐水中，用直尺设定好标尺后照相，用Image-Pro Plus(IPP)图像处理软件计算得出缺血面积，计算心肌缺血面积占心室面积的百分比。

3 结果

3.1 对心肌梗死的影响 以心尖处变为苍白色为心肌梗死缺血的成功标志，经过1%红四氮唑进行心脏染色。心脏切片染色结果显示，正常组心尖显现粉红色，模型组中苍白色的范围较广，说明与正常组相比模型组缺血坏死心肌组织较多；与模型组比较，迷迭香提取物(MDX 60)和灯盏花素(EBHM)4个不同治疗组的心脏切片染色结果也出现不同程度的苍白色，但心肌梗死范围没有模型组明显，说明各治疗组能有效缩小心肌梗死范围，在一定程度上可保存更多的存活心肌。见图1。图中缺血为浅色，正常为深色。

3.2 对心肌梗死范围的影响 与模型组比较，MDX60(17mg/kg、68mg/kg)和EBHM(170mg/kg、680mg/kg)的缺血面积百分比明显缩小(Plt;0.01)；MDX 60低剂量组与EBHM低剂量组的缺血面积百分比相近，MDX 60高剂量组和EBHM高剂量组相比缺血面积有所增大。说明MDX 60可以通过减小心肌梗死面积，发挥对大鼠心肌缺血再灌注损伤的护作用，低剂量MDX 60对大鼠心肌梗死面积的保护效果和低剂量EBHM的保护作用一致。见表1。

4 讨论

心肌缺血再灌注在减少急性心肌梗死面积的同时，由于冠状动脉的骤然开通与血流恢复，引起血管内皮细胞功能异常、激活炎症因子等，导致再灌注损伤心肌缺血出现极高的发病率以及致死率。大量的动物实验及临床研究已经证实心肌缺血再灌注损伤的治疗方法主要是清除心肌细胞氧自由基，通过阻止细胞内钙超载和抑制mPTP开放来减轻线粒体损伤和细胞内钙超载，抑制中性粒细胞活性和NF-κB 及促炎性细胞因子的释放发挥抗炎作用，调节细胞内能量代谢、改善血管内皮细胞代谢以及抑制心肌细胞凋亡[6]。近年研究表明，中药可作用于心肌缺血再灌注损伤的多个环节发挥心肌保护作用，其主要作用机制与清除氧自由基、减轻钙超载、改善能量代谢、干预炎症反应、调节血管内皮因子、抑制细胞凋亡有关[7]。

表1 迷迭香提取物对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌梗死范围的影响

注：与模型组比较，*Plt;0.05,△Plt;0.01。

迷迭香是一种广泛使用的中草药，体内外的研究表明，迷迭香活性提取物具有抗氧化，抑制肝癌细胞、乳腺癌细胞增殖，抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、植物病原真菌生长等作用，还具有抗病毒、抗炎、诱导T 细胞活化，抗血管形成等作用，对帕金森病、阿尔茨海默病、血管性痴呆也有一定的治疗作用[8]。迷迭香脂溶性提取物对大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO) 模型有明显保护作用，能明显改善模型大鼠的神经功能障碍，减轻模型大鼠的脑梗塞范围，对脑系数有降低趋势，降低模型大鼠ADP 诱导的血小板聚集率[9]。迷迭香酸能够显著改善脑缺血再灌注大鼠的行为障碍和减少脑梗塞体积，可以显著抑制脑缺血再灌注大鼠MDA的生成，明显升高SOD和GSH-Px的活性[10]。

本实验采用大鼠心肌缺血再灌注损伤模型研究迷迭香提取物的作用，实验结果表明，大鼠心肌缺血再灌注损伤后使用迷迭香提取物进行干预治疗，心肌梗死面积会减少，低剂量的迷迭香提取物比灯盏花素提取物对大鼠心肌梗死面积发挥更好的保护效果，有效地减轻缺血再灌注对其心肌细胞造成的损伤，使心肌病变的程度明显减轻，进而发挥对心肌的保护作用，对进一步研究心肌缺血性疾病的防治奠定基础。

[1]王宁,严冬.中医药抗心肌缺血再灌注损伤的研究进展[J].山东中医药大学学报，2016,40(2):188-191.

[2]周金林.迷迭香抗氧化提取物的开发与应用价值研究[J].现代商贸工业，2011,(22):342.

[3]冀思华，曹圣楷，曾光尧，等.迷迭香二萜酚类成分鼠尾草酸的研究进展[J].中南药学，2014,12(8):788-792.

[4]刘锡强,李丽,田京伟.迷迭香酸对大鼠心肌缺血损伤保护作用机制的探讨[J].中成药，2011,33(7):1232-1234.

[5]徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学[M]. 北京：人民卫生出版社，2002：45.

[6]陈辉,郑敏,叶华山.心肌缺血再灌注损伤机制及治疗研究进展[J].湖北科技学院学报(医学版)，2015,29(3):262-265.

[7]李伟,沈明勤,陆晓晖.中药防治心肌缺血再灌注损伤作用机制的研究进展[J].中华中医药杂志，2011,26(3):549-553.

[8]周慧灵,梁婉娴,徐道立,等. 迷迭香活性提取物的药理作用研究进展[J]. 环球中医药，2015,8(12):1542-1545.

[9]张兰春，于浩飞，程先睿，等. 迷迭香脂溶性提取物对MCAO 型大鼠脑缺血的保护作用[J].中药药理与临床，2014,30(6):109-111.

[10]高丽萍，张文斌，景玉宏，等. 迷迭香酸对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及机理探讨[J].亚太传统医药，2011，7(12):8-9.

ProtectiveEffectofRosemaryExtractonRatswithMyocardialIschemiaReperfusionInjury

ZHANG Lanchun1CHENG Xianrui2YU Haofei1HU Weiyan1GAO xiuli3ZHANG Rongping1*

1. Kunming Medical University，Kunming 650500,China; 2. Jiangxi Yugan County People’s Hospital，Yugan 335100,China;3.Guizhou Medical University, Guiyang 550004,China

ObjectiveTo observe the protective effects of rosemary extract(MDX 60) on myocardial ischemia-reperfusion injury in rats.MethodsTotally 50 SD rats were randomly divided into model group，Dengzhanhua(EBHM) extract 170、680mg/kg control groups, and MDX 60 170、680mg/kg treated groups(n=10). The myocardial ischemia reperfusion injury model was established through occluding the left anterior descending branch of coronary artery for 40 min and removing the ligation later to reperfuse for 30 min in vivo．Different doses of aqueous extract were intragastrically administered once per day for 4 days before operation．Using 1%TTC staining measure myocardial infarct size, and Image-Pro Plus image processing software was used to gauge the size vary from myocardial ischemia area.ResultsCompared with myocardial ischemia reperfusion control group，the percentage of ischemic area with MDX 60 extract 170,680mg/kg groups and EBHM extract 170,680mg/kg groups were significantly decreased(Plt;0.01); ischemia area percentage in low dose group of MDX 60 and EBHM is similar，while，compared with EBHM the ischemia area in high dose group of MDX 60 is increased.ConclusionMDX 60 can reduce the myocardial infarct size and exert a protective effect on myocardial ischemia reperfusion injury in rats. The effect of low dose MDX 60 on myocardial infarct size in rats was better than EBHM.

Rosemary Extract; Myocardium Ischemia-reperfusion; Myocardial Infarction Range; Protection

十二五国家科技支撑计划(2014BAI01B01～04);云南省自然科学基金——昆明医科大学联合专项(2015FB006，2016FB014); 云南省天然药物药理重点实验室开放基金(2014G003)。

张兰春(1988-)，女，白族，硕士研究生，实验师，研究方向为中药药理研究。E-mail：zhlch_2010@163.com

张荣平(1964-)，男，汉族，博士研究生，教授，研究方向为天然药物化学及新药研究。E-mail:zhrpkm@163.com

R285.5

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1007-8517(2017)21-0026-04

2017-09-09 编辑：梁志庆)