电针对高血压前期Dahl大鼠肾脏CaM/NO通路的影响

王建波,曲怡,张立德

(辽宁中医药大学中医脏象理论及应用教育部重点实验室,沈阳 110847)

电针对高血压前期Dahl大鼠肾脏CaM/NO通路的影响

王建波,曲怡,张立德

(辽宁中医药大学中医脏象理论及应用教育部重点实验室,沈阳 110847)

目的探讨电针对高血压前期 Dahl盐敏感大鼠模型肾脏 CaM-eNOS-NO信号通路的影响。方法 将30只7周龄雄性Dahl盐敏感大鼠(Dahl salt-sensitive rats, DS)按照随机数字表法随机分为模型组、针刺组和非经非穴组。选择7周龄雄性盐抵抗大鼠(Dahl salt-resistant rats, DR)10只作为空白组。大鼠统一喂养于SPF动物实验中心,在1星期适应性喂养结束后,改为8% NaCl高盐饲料喂食。其间采用智能无创血压计监测大鼠血压,当12 d后血压值升至120～139/80～89 mmHg范围时,确定为高血压前期大鼠模型。停止高盐喂养,改为普通饲料。空白组、模型组采取普通固定 15 min,不予治疗;针刺组予以双侧曲池、足三里电针治疗;非经非穴组在双侧髂嵴上10～15 mm、后正中线旁开20 mm区段内选择1个固定对照点进行电针治疗。每日1次,每星期治疗6次,连续治疗5星期。取大鼠左肾组织,荧光定量PCR法检测CaM、eNOS的mRNA表达,western blot和免疫组化法对eNOS进行定量和定位检测,Elisa法测定NO含量表达。结果与空白组比较,模型组CaM、eNOS的mRNA表达显著降低(P＜0.05),eNOS的蛋白含量明显减少(P＜0.05),NO含量也明显降低(P＜0.05)。与模型组比较,针刺组CaM、eNOS的mRNA表达显著升高(P＜0.05),eNOS的蛋白含量显著增多(P＜0.05),NO含量也明显升高(P＜0.05)。与模型组比较,非经非穴组CaM表达虽明显增高(P＜0.05),但是eNOS中mRNA表达、NO含量均无统计学差异(P＞0.05)。结论电针曲池、足三里对高血压前期 DS大鼠肾脏保护作用可能与上调大鼠肾脏CaM-eNOS-NO信号通路有关。

针刺疗法;电针;高血压前期;Dahl盐敏感大鼠;eNOS;一氧化氮;穴,曲池;穴,足三里

高血压前期是正常血压与高血压间的一个过渡阶段。随着高血压疾病的危害被越来越多的人了解,高血压前期的研究也逐渐被医生及学者重视。已有研究证实,在高血压前期便存在临床和亚临床靶器官损伤和功能障碍[1]。高血压前期虽然与心脑肾血管风险性密切相关[2],但是因为不能达到西药降压的标准,不能进行药物治疗。针灸根据其未病先治理论依据,常用于高血压前期的治疗,疗效显著而受到重视[3-4]。但是关于针灸对高血压前期作用机制研究却鲜有报道。

目前研究认为高血压前期出现病理改变主要是内皮细胞的损伤[5]。内皮细胞能通过释放内源性舒张收缩因子,控制血管的收缩与舒张,调节血管紧张度。一氧化氮(NO)是内皮细胞中具有扩血管作用的代表性内皮衍生因子,内皮细胞的损伤会导致NO的释放与合成减少。据此,本实验采用Dahl盐敏感大鼠(Dahl saltsensitive rats, DS)作为典型的大鼠高血压前期模型,通过观察电针曲池、足三里对DS大鼠肾脏CaM-eNOSNO信号通路的作用,探讨电针对高血压前期盐敏感大鼠肾脏的保护机制,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

选用 7周龄盐抵抗大鼠(Dahl salt-resistant rats, DR)10只,雄性,体质量为160～180 g;7周龄DS大鼠30只,雄性,体质量为160～180 g,均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[许可证号 SCXK(京) 2012-0001]。

将DR大鼠10只作为空白组;DS大鼠按照查随机数字表法分为模型组、针刺组和非经非穴组,每组 10只。动物实验过程中对动物的处置符合2006年国家科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

1.2 主要试剂及仪器

大鼠针刺针具采用健康牌0.16 mm×10 mm不锈钢毫针[苏食药监械(准)字2011第2270872号];Trizol Reagent(Invitrogen life technologies);荧光定量PCR试剂盒(Agilent Technologies);PCR反转试剂盒(ProtoScript First Strand);PCR引物(武汉金开瑞生物工程有限公司);荧光定量 PCR仪(Applied Biosysterms 7500 Fast Real-Time PCR Systerm);氯仿(安徽时联特种溶剂股份有限公司);异丙醇(国药集团化学试剂有限公司);无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司);无核酸酶水配制,由500 mL超纯水和0.5 mL DEPC混合,过夜,并高压灭菌;NO Elisa试剂盒购自Elisa Biotech公司(Cat.#EIA-3673);EnoGene RIPA裂解液(E1WP106);EnoGene BCA蛋白浓度测定试剂盒(E1WP201);凝 胶 制 备 试 剂 盒 (博 士 德 生 物AR0138);EnoGene 5×SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(E1WP303); β-actin Mouse Monoclonal Antibody (E12-041);HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)(E030120-01);eNOS一抗(北京博奥森生物技术有限公司);ECL发光液 Thermo(Prod NCI5079 Lot PA197033)。

1.3 模型建立

大鼠统一在SPF级动物中心饲养。所有大鼠采用由北京科奥协力饲料有限公司提供的含8% NaCl高盐饲料喂食 12 d,每星期采用智能无创血压计监测大鼠血压。在饲养12 d后,DS大鼠血压值升至120～139/ 80～89 mmHg范围,认为高血压前期大鼠模型造模成功,停止高盐喂养,改为由辽宁本溪长生生物技术有限公司提供的普通饲料喂养。

在高盐饲养期间,每日更换 1次无菌垫料保证清洁;普通饲养时,每2 d更换1次无菌垫料,自由饮水。

1.4 干预方法

空白组、模型组采用和针刺组相同的方法固定,不予以其他干预;针刺组采用自制的兔台、袜套固定方法捆绑大鼠[6]。穴位定位参照《实验针灸学》[7]定位方法,足三里选取膝关节后外侧、腓骨小头下约5 mm处,直刺 7 mm;曲池选取桡骨近端的关节外侧前方的凹陷中,直刺 4 mm。非经非穴组选择经络循行经过较少的胁下部位选取[8],取双侧髂嵴上10～15 mm、后正中线旁开20 mm区段内一个固定对照点。接苏州医疗用品厂有限公司出品的华佗牌电针仪,采用疏密波,其中疏波为1 Hz,密波为5 Hz;疏波时间为10 s,密波时间为15 s,电流调节至鼠尾或者下肢微微抽动即可。每日1次,每次治疗20 min,连续6 d为1个疗程并休息1 d,共治疗5星期。

1.5 取材

DS和 DR大鼠治疗结束后,每组大鼠禁食不禁水12 h,腹腔注射 10%水合氯醛溶液,剂量按照0.4 mL/100 g给药,待其完全麻醉后,固定于实验台上,用 0.5%碘伏消毒大鼠腹部皮肤,沿腹中线迅速打开腹腔,取大鼠左肾组织置于无菌 EP管中,经液氮冷冻后于-80℃冰箱储存。

1.6 观察指标

1.6.1 大鼠血压变化

每星期用智能无创血压计监测大鼠血压,结果见表1。

表1 各组大鼠不同时间点血压比较 (±s,mmHg)

表1 各组大鼠不同时间点血压比较 (±s,mmHg)

注:与空白组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05

组别 n 治疗前血压 治疗后1星期 治疗后2星期 治疗后3星期 治疗后4星期空白组 10 113.00±3.16 107.25±6.02 111.50±3.42 115.50±3.42 119.50±1.29模型组 10 130.75±4.791) 136.50±9.811) 128.50±6.611) 132.25±4.991) 137.50±4.201)针刺组 10 134.00±2.201) 120.50±6.861)2) 116.00±2.941)2) 113.50±1.732) 118.00±2.942)非经非穴组 10 133.75±3.301) 127.75±4.571)2) 124.75±5.741)2) 123.50±5.071)2) 125.00±2.581)2)

1.6.2 NO浓度检测

使用 Elisa法检测 NO浓度。分别取左肾组织100 mg,加入PBS制成10%匀浆液。离心抽取上清,设置空白孔、标准孔和样本孔。在标准孔依次加不同浓度的标准品 50 μL,样本孔中加入待测样本 50 μL;加入辣根过氧化物酶(HRP)检测的抗体100 μL,37℃水浴60 min;洗涤4～5次;加入底物A、B各50 μL,37℃避光15 min;再加入终止液50 μL,450 nm波长测定OD值;用标准品孔绘制y=ax+b曲线,计算出各组NO浓度。

1.6.3 CaM、eNOS的mRNA检测

左肾组织经液氮研磨后,以Trizol裂解方法提取总mRNA。测量mRNA浓度进行逆转录过程,加入引物及扩增所需试剂,Rox法荧光定量检测CaM、eNOS的mRNA含量。扩增引物序列(见表 2)。反应条件如下,95℃10 min,1个循环;95℃ 30 s,59℃ 30 s,72℃ 30 s,40个循环。使用ΔΔct法进行数据检测与处理。

1.6.4 Western blot检测eNOS蛋白含量表达

取左肾组织 100 mg加入 RIPA裂解液后研磨离心,BCA法测定蛋白浓度;加入蛋白上样缓冲液,100℃8 min。按照每组蛋白上样量80 μg进行电泳,电压为浓缩胶80 V,分离胶120 V;转膜80 mA 3 h;TBST配5%脱脂奶粉封闭,37℃ 1 h;eNOS一抗1:200稀释,4℃过夜;二抗浓度 1:2000,37℃ 1 h;使用凝胶成像系统曝光。

表2 各基因PCR扩增的特异性引物序列

1.7 统计学方法

数据采用SPSS 19.0软件进行统计分析。结果以均数±标准差表示,组间两两比较采用单因素方差分析,组间方差齐采用LSD检验法,方差不齐采用Tamhane’s T2检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肾组织NO含量比较

由表3可见,模型组、针刺组、非经非穴组大鼠肾组织 NO含量与空白组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。针刺组肾组织NO含量与模型组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05)。非经非穴组肾组织NO含量与模型组比较,差异则无统计学意义(P＞0.05)。

表3 各组大鼠肾组织NO含量比较 (±s,μmol/L)

表3 各组大鼠肾组织NO含量比较 (±s,μmol/L)

注:与空白组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05

组别 n NO含量

2.2 各组大鼠肾组织CaM、eNOS中mRNA含量比较

由表4可见,模型组、针刺组、非经非穴组肾组织CaM、eNOS中mRNA含量与空白组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。针刺组肾组织CaM、eNOS中mRNA含量与模型组及非经非穴组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。非经非穴组肾组织CaM中mRNA含量与模型组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05)。非经非穴组肾组织eNOS中mRNA含量与模型组比较,差异则无统计学意义(P＞0.05)。

表4 各组大鼠肾组织CaM、eNOS中mRNA含量比较(±s)

表4 各组大鼠肾组织CaM、eNOS中mRNA含量比较(±s)

注:与空白组比较 1)P＜0.05;与模型组比较 2)P＜0.05;与非经非穴组比较3)P＜0.05

组别 n CaM eNOS空白组 10 1.41±0.14 1.34±0.46模型组 10 1.00±0.001) 1.00±0.001)针刺组 10 1.95±0.131)2)3) 1.47±0.091)2)3)非经非穴组 10 1.76±0.591)2) 1.09±0.381)

2.3 各组大鼠肾组织eNOS灰度值比较

由表 5及图 1可见,与空白组比较,模型组 eNOS蛋白含量显著降低,差异具有统计学意义(P＜0.05);与模型组比较,针刺组 eNOS蛋白含量显著升高,差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表5 各组大鼠肾组织eNOS灰度值比较 (±s)

表5 各组大鼠肾组织eNOS灰度值比较 (±s)

注:与空白组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05

组别 n eNOS灰度值空白组 10 1.28±0.01模型组 10 0.98±0.031)针刺组 10 1.16±0.021)2)非经非穴组 10 1.00±0.021)

图1 各组大鼠肾组织eNOS蛋白表达

3 讨论

近年来,随着人们饮食方式与生活方式的变化,我国高血压发病率与相关危险因素均有显著升高趋势。2002年卫生部组织的全国居民27万人的营养与健康状况资料调查中证明,我国18岁以上居民高血压患病率与1991年比较上升31%。体重状况与1992年比较,成人超重率上升 39%,肥胖率上升 97%[9]。目前国际公认高血压病危险因素为超重、高盐膳食与中度以上饮酒,这些均与脾胃运化息息相关,为从脾胃论治高血压前期提供了依据[10-13]。

高血压前期往往表现为“眩晕”“头痛”“不寐”等异常状态。这些往往是因为高血压导致脑小动脉痉挛,继而发生脑动脉硬化、脑供血不足等病理改变。归根到底,高血压归属于血管病变,故中医病因病机也应从血脉论治[14-17]。高血压前期作为高血压的一种未病状态,可选取多气多血的阳明经穴位作为选穴依据。刘海华等[18]对临床降压常用穴位进行 Meta文献分析显示,曲池使用频率达48.6%,足三里使用频率在30.6%。本实验根据调理脾胃的原则,选用足三里作为降压主穴,配以阳明经同气相通之曲池治疗高血压前期。以期证明针刺具有保护机体,防止高血压前期并发症发生的作用。并据此探讨针刺治疗疾病机理,为临床针灸治疗疾病提供理论依据。

CaM-eNOS-NO信号通路与高血压前期肾脏病理改变有很大关联。NO作为内源性血小板抑制剂及抗氧化剂,除可以使血管扩张以外,还有维持血管内皮抗凝和抗血栓形成的作用,在肾脏内皮细胞保护中起到重要的作用。Billon A等[19]在研究中表明,敲除eNOS基因后,小鼠体内17β-E2失去了其对血管内皮的保护作用,说明eNOS的存在是血管内皮保护作用的关键因素。

高血压前期作为高血压的未病状态,并未构成降压药治疗标准,而且经循证医学研究证实,抗高血压药物的主导作用是控制高血压本身,对降低靶器官损害和发生作用不大。在临床治疗中,既能控制血压,又能保护靶器官不受损伤异常重要。本研究结果显示,模型组DS大鼠与空白组相比,CaM,eNOS mRNA基因表达、eNOS蛋白表达,肾组织NO含量均显著降低。在经过电针治疗后,该信号通路基因蛋白表达均显著升高。证明了电针对高血压前期机体的保护作用,为广大学者及临床工作者研究针刺机制提供了新的思路。

[1] 许先进.高血压前期靶器官损伤的研究进展[J].中华高血压杂志,2010,18(3):217-219.

[2] 黄裕立.高血压前期和心脑肾血管风险相关性的研究[D].南方医科大学,2014.

[3] 周敏,郭治波,杜宇征.针灸治疗原发性高血压病临床研究进展[J].中华中医药杂志,2011,26(12):2939-2942.

[4] 李洪波,周铁军,陈敏,等.针灸调治高血压前期理论初探[J].辽宁中医杂志,2014,41(3):546-548.

[5] Weil BR, Stauffer BL, Greiner JJ,et al. Prehypertension is associated with impaired nitric oxide-mediated endothelium-dependent vasodilation in sedentary adults [J].Am J Hypertens, 2011,24(9):976-981.

[6] 王建波,曲怡,张立德.关于大鼠针刺、固定方法的研究与探讨[J].针灸临床杂志,2015,31(8):73-74.

[7] 李忠仁.实验针灸学[M].北京:中国中医药出版社, 2007:255-257.

[8] 林莺,纪峰,黄桂榕,等.针刺实验研究中大鼠非经非穴选取方法及思考[J].针刺研究,2013,38(4):334-338.

[9] 王琦,朱燕波,吴玉娥,等.肥胖、超重与正常体质量高血压患者的中医体质类型分布特点比较研究[J].中华中医药杂志,2011,26(8):676-679.

[10] Ko SC, Jung WK, Lee SH,et al. Antihypertensive effect of an enzymatic hydrolysate from Styela clava flesh tissue in type 2 diabetic patients with hypertension[J].Nutr Res Pract, 2017,11(5):396-401.

[11] Plotnikov MB, Shamanaev AY, Aliev OI,et al. Pentoxifylline treatment enhances antihypertensive activity of captopril through hemorheological improvement in spontaneously hypertensive rats during development of arterial hypertension[J].J Am Soc Hypertens, 2017,11 (11):769-778.

[12] Sanidas E, Papadopoulos DP, Grassos H,et al. Air pollution and arterial hypertension. A new risk factor is in the air[J].J Am Soc Hypertens, 2017,11(11):709-715.

[13] Jones LM, Rosemberg MS, Wright KD. Opportunities for the Advanced Practice Nurse to Enhance Hypertension Knowledge and Self-management Among African American Women[J].Clin Nurse Spec, 2017,31(6): 311-318.

[14] 石学敏,申鹏飞.从针刺人迎穴降压谈针灸学的原始创新[J].上海针灸杂志,2010,29(2):67-68.

[15] 张燕军,栗振杰,高旸,等.针刺与针药联合治疗轻、中度原发性高血压疗效的Meta分析[J].辽宁中医杂志, 2014,41(9):1802-1806.

[16] 徐国峰,余惠萍,李敏.平衡针治疗原发性高血压即刻疗效的临床研究[J].上海针灸杂志,2015,34(7):632-634.

[17] 吴朝进.耳穴贴压对高血压患者靶器官保护作用的临床研究[J].上海针灸杂志,2017,36(4):409-413.

[18] 刘海华,王莹莹,高海波,等.针灸治疗高血压病选穴规律文献研究[J].中医杂志,2014,55(12):1055-1058.

[19] Billon A, Lehoux S, Lam Shang Leen L,et al. The estrogen effects on endothelial repair and mitogenactivated protein kinase activation are abolished in endothelial nitric-oxide (NO) synthase knockout mice, but not by NO synthase inhibition by N-nitro-L-arginine methyl ester[J].Am J Pathol, 2008,172(3):830 -838.

Effect of Electroacupuncture on Renal CaM/NO Pathway in Dahl Rats with Prehypertension

WANG Jian-bo,QU Yi,ZHANG Li-de.Ministry of Education Key Laboratory of TCM Visceral Manifestation Theory and Application,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang110847,China

ObjectiveTo investigate the effect of electroacupuncture on renal CaM-eNOS-NO signal pathway in Dahl salt-sensitive rats with prehypertension.MethodsThirty 7-week-old male Dahl salt-sensitive rats (DS) were allocated, using a random number table, to model, acupuncture and non-meridian-acupoint groups. Ten 7-week-old male Dahl salt-resistant rats (DR) were used as a blank group. The rats were fed in a SPF animal experiment center. An 8% NaCl high salt diet was provided after 1-week adaptive feeding. During the period, rat blood pressure was monitored using an intelligent noninvasive sphygmomanometer. A rat model of prehypertension was successfully made if rat blood pressure rose to 120～139/80～89 mmHg after 12 days. At that time, a high salt diet was stopped and a normal diet was provided. The blank and model groups

15-minute regular fixation and no treatment. The acupuncture group received electroacupuncture at bilateral Quchi and Zusanli. The non-meridianacupoint group received electroacupuncture at fixed control points selected between 10 and 15 mm above bilateral iliac crests 20 mm lateral to the midline. Treatment was given once daily, 6 times a week, for five consecutive weeks. The left rat kidney was taken. CaM and eNOS mRNA expressions were determined by quantitative fluorescence PCR. eNOS was quantified and located by western blot and immunohistochemical method. NO content was measured by ELISA.ResultsAs compared with the blank group, CaM and eNOS mRNA expressions, eNOS protein content and NO content decreased significantly in the model group (allP＜0.05). As compared with the model group, CaM and eNOS mRNA expressions, eNOS protein content and NO content increased significantly in the acupuncture group (allP＜0.05). As compared with the model group, CaM expression increased significantly (P＜0.05) but eNOS mRNA expression and NO content had no statistically significant differences (P＞0.05) in the non-meridian-acupoint group.ConclusionThe renoprotective effect of electroacupuncture at Quchi and Zusanli may be related to upregulating renal CaM-eNOS-NO signal pathway in DS rats with prehypertension.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Prehypertension; Dahl salt-sensitive rats; eNOS; Nitric oxide; Point, Quchi; Point, Zusanli

1005-0957(2017)11-1367-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.11.1367

辽宁省教育厅创新团队项目(LT2014021);辽宁省自然科学基金(20170540593)

王建波(1991—),男,助理实验师,Email:541773565@qq.com

张立德(1959—),男,教授,研究方向为高血压病因病机及针灸、中药防治机制研究,Email:zhldtcm@163. com

2017-05-13