针刺对SAMP8小鼠海马Flotillin-1、NEP及Aβ42表达的影响

李广诚,龙聪,朱宏,董克礼,任丹,梁梅亭,李雅悦

(中南大学湘雅三医院,长沙 410013)

针刺对SAMP8小鼠海马Flotillin-1、NEP及Aβ42表达的影响

李广诚,龙聪,朱宏,董克礼,任丹,梁梅亭,李雅悦

(中南大学湘雅三医院,长沙 410013)

目的探讨针刺对阿尔茨海默病模型小鼠SAMP8的行为学影响及其作用机制。方法将60只6月龄雄性SAMP8小鼠随机分为针刺治疗组、模型对照组和非穴位对照组,每组20只,另备同月龄雄性SAMR1小鼠20只作为正常对照组。针刺治疗组采用针刺肾俞、百会、血海、膈俞进行干预。8星期后,采用Morris水迷宫对各组小鼠的行为学进行检测,同时采用western blot检测小鼠海马组织Flotillin-1、NEP以及Aβ42表达情况。结果Morris水迷宫实验中,与模型对照组比较,针刺治疗组小鼠的逃避潜伏期明显缩短(P＜0.05),其停留在原平台象限的时间和穿越原平台次数增加(P＜0.05);与模型对照组比较,非穴位对照组小鼠的逃避潜伏期无明显差别(P＞0.05),其停留在原平台象限的时间和穿越原平台次数也无明显差别(P＞0.05)。Flotillin-1在针刺治疗组的表达较模型对照组明显减弱(P＜0.05),而在非穴位对照组与模型对照组之间,Flotillin-1的表达水平无明显差别(P＞0.05);NEP在针刺治疗组的表达较模型对照组明显增强(P＜0.05),而在非穴位对照组与模型对照组之间,NEP的表达水平无明显差别(P＞0.05);Aβ42在针刺治疗组的表达较模型对照组明显减弱(P＜0.05),而在非穴位对照组与模型对照组之间,Aβ42的表达水平无明显差别(P＞0.05)。结论针刺能够明显改善AD模型小鼠SAMP8的学习记忆能力,降低SAMP8小鼠海马Flotillin-1含量及上调NEP的表达,从而减少Aβ42表达,减轻神经毒性,发挥神经保护作用。

针刺疗法;阿尔茨海默病;SAMP8;小鼠;痴呆

阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是发生于老年和老年前期、以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变。其主要表现为记忆障碍、失语、失用、失认等改变。AD是老年期最常见的痴呆类型,占老年期痴呆的50%～70%。AD典型病理改变是脑神经炎性斑、神经元纤维缠结、神经元减少及颗粒空泡变性等。随着我国快速的人口老龄化进程,AD已然成为一个不可回避的公共卫生问题。

Aβ级联学说是 AD病因机制中学界认可程度最高的发病假说。它认为Aβ启动了AD的发病过程,Aβ的生成过多、降解减少及细胞外Aβ沉积是AD发病最原始、最重要的病因,在 AD发生、发展中起关键作用。Flotillin-1与Aβ的生成密切相关,可以为APP生成Aβ提供工作平台从而促进 Aβ的产生。中性内肽酶(neprilysin, NEP)是体内催化Aβ降解的关键酶,是调节大脑Aβ水平的重要因素,NEP可以增加Aβ的降解。因此,对Flotillin-1、NEP的表达进行调节会影响Aβ的代谢过程。

目前AD尚没有有效的治疗策略[1]。针刺疗法是中医学的精髓之一,具有双向调节及良性调节的特点,且操作简便、无毒副反应,近年来针刺在AD治疗中的临床运用,显示了十分理想的前景[2]。“补肾活血”针刺法是本课题组临床治疗阿尔茨海默病的常用方法之一,在前期研究中,笔者发现“补肾活血”针刺法能够改善AD患者的认知功能,降低AD患者体内异构前列腺素的水平,减轻患者体内脂质过氧化状态[3],同时笔者也在动物实验中发现“补肾活血”针刺法能够改善AD模型小鼠(senescence accelerated mouse P8, SAMP8)的学习记忆能力,其作用机制可能涉及抗氧化应激,抑制AChE活性,调节 Ach代谢,改善胆碱能系统功能等方面[4-7]。本研究旨在观察针刺对AD模型小鼠SAMP8海马Flotillin-1、NEP以及Aβ42表达的影响,从Aβ代谢角度阐释针刺对阿尔茨海默病的治疗机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6月龄雄性AD模型小鼠SAMP8共60只,同龄雄性正常老化小鼠SAMR1共20只,均由天津中医药大学第一附属医院动物实验中心提供(实验动物质量合格证NO0001353),小鼠体重为(24±3.5)g。

1.2 试剂与仪器

甘氨酸、Tris、SDS、Tween-20(武汉天源慧达生物科技有限公司);Na2HPO3·12H2O、NaH2PO3·2H2O、NaCl、KCl(上海国药集团化学试剂有限公司);BPB(上海三爱思试剂有限公司);甘油(天津市化学试剂三厂);2-ME、无水甲醇(上海振兴化工一厂);PVDF膜(德国Milipore公司);显影底物(美国Thermo公司)。

Morris水迷宫(中南大学湘雅医学院神经生物中心);电泳仪(北京六一仪器厂);电泳槽;转移槽;低温高速离心机。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组与处理

将60只6月龄雄性SAMP8小鼠随机分为针刺治疗组、SAMP8模型对照组及SAMP8非穴位对照组,每组20只。另备20只6月龄雄性SAMR1小鼠作为正常对照组。所有小鼠均喂养于层流室,温度为 18℃～22℃,湿度为55%～58%,饮用水及所食饲料均高温蒸汽灭菌。

针刺治疗组选取百会、血海、肾俞、膈俞。百会向后平刺 3～5 mm,血海、肾俞直刺 2～3 mm,膈俞以80°角斜向上刺2～3 mm,其中血海、肾俞、膈俞先刺激左侧穴位,次日再刺激右侧,交替进行。小鼠穴位定位以及针刺深度均参照《实验针灸学》[8]。进针后,补泻手法参考石学敏院士的针刺手法量学标准进行[9],血海、膈俞施捻转泻法,施针幅度为180°～360°,施针频率为50～60次/min;肾俞、百会施捻转补法,施针幅度 60°～90°,施针频率为 120～150次/min,运针1 min,留针10 min。

SAMP8非穴对照组取双侧肋下固定非经非穴点,用平补平泻捻转手法进行刺激,施针幅度 90°,施针频率为90次/min,运针1 min,留针10 min。

SAMP8模型对照组及SAMR1正常对照组小鼠进行与以上两组相同时间程度的捉抓刺激。

各组每日做相应处理1次,第7天暂停1次,连续干预8星期。

1.3.2 行为学测试

在治疗结束后的第1天,各组小鼠开始在Morris水迷宫中进行行为学测试。前5 d进行隐蔽平台试验,最后1 d进行空间探索试验。

1.3.3 Western blot步骤

行为学结束后将小鼠迅速断头处死,取出完整脑组织,用冷生理盐水冲洗后置于冰盘上剥离脑膜,取出海马组织,将小鼠海马组织,按照1:2的比例加入全细胞裂解液,经匀浆、超声破碎后,用Bradford法进行蛋白定量,SDS-PAGE凝胶电泳,转NC膜。洗涤后膜和检测的一抗(1:500)进行结合,洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的二抗Goat Anti Rabbit IgG/HRP(1:10000),化学发光试剂检测,X线片显影。

1.4 统计学方法

采用SPSS18.0软件对数据进行统计分析。所有数据以均数±标准差表示,采用单因素方差分析(One-way ANOVA),方差齐性时,用LSD或SNK检验进行两两比较;方差不齐时,用秩和检验,组间比较用Kruskal-Wallist test。

2 结果

2.1 各组行为学测试结果

由表 1及图 1可见,隐蔽平台实验从干预后第 1天开始,模型对照组小鼠逃避潜期明显长于正常对照组(P＜0.05);针刺治疗组小鼠逃避潜伏期明显小于模型对照组(P＜0.05),多于正常对照组(P＜0.05);模型对照组及非穴位对照组小鼠之间逃避潜伏期无明显差别(P＞0.05)。由表2及图2-3可见,在最后1天的探索试验中,模型对照组小鼠停留在原平台象限的时间和穿越原平台次数明显少于正常对照组(P＜0.05);针刺治疗组小鼠停留在原平台象限的时间和穿越原平台次数明显多于模型对照组(P＜0.05),少于正常对照组(P＜0.05);而模型对照组与非穴位对照组小鼠之间的停留时间和穿台次数无明显差别(P＞0.05)。

图1 各组干预后小鼠隐蔽平台实验逃避潜伏期比较

图2 各组干预后探索试验穿越平台次数比较

图3 各组干预后探索试验停留原平台象限时间比较

表1 各组干预后小鼠隐蔽平台实验逃避潜伏期比较 (±s,s)

表1 各组干预后小鼠隐蔽平台实验逃避潜伏期比较 (±s,s)

注:与正常对照组比较1)P＜0.05;与模型对照组比较2)P＜0.05;与非穴位对照组比较3)P＜0.05

组别 n 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天正常对照组 2 0 7 3 . 3 2 ± 2 . 0 6 5 7 . 4 7 ± 3 . 8 0 3 9 . 0 8 ± 5 . 4 6 3 4 . 9 8 ± 6 . 0 7 3 2 . 2 0 ± 4 . 0 3模型对照组 2 0 7 9 . 9 5 ± 2 . 4 1 1) 6 9 . 8 8 ± 2 . 8 4 1) 6 3 . 1 6 ± 4 . 0 9 1) 5 9 . 2 6 ± 2 . 7 3 1) 5 6 . 7 0 ± 3 . 1 9 1)非穴位对照组 2 0 8 0 . 5 0 ± 2 . 5 8 1) 7 0 . 8 8 ± 3 . 7 5 1) 6 2 . 9 1 ± 2 . 9 8 1) 5 9 . 5 0 ± 2 . 5 7 1) 5 6 . 5 1 ± 3 . 2 2 1)针刺治疗组 2 0 7 6 . 3 4 ± 3 . 1 2 1)2)3) 6 5 . 0 3 ± 3 . 1 7 1)2)3) 5 0 . 3 0 ± 4 . 2 2 1)2)3) 4 5 . 9 3 ± 3 . 9 6 1)2)3) 4 0 . 5 6 ± 3 . 6 9 1)2)3)

表2 各组干预后探索试验各项指标比较 (±s)

表2 各组干预后探索试验各项指标比较 (±s)

注:与正常对照组比较 1)P＜0.05;与模型对照组比较 2)P＜0.05;与非穴位对照组比较3)P＜0.05

组别 n 穿越平台次数(次) 停留原平台象限时间(s)正常对照组 20 9.00±2.20 30.98±5.85模型对照组 20 4.50±1.961) 15.43±2.601)非穴位对照组 20 4.90±2.221) 15.68±2.611)针刺治疗组 20 6.90±1.681)2)3) 22.20±3.891)2)3)

2.2 Western blot结果

本研究采用 western blot方法检测 NEP、Aβ42以及Flotillin-1在模型对照组、针刺治疗组、非穴位对照组以及正常对照组小鼠海马的表达水平。

实验结果显示,干预后 Flotillin-1在正常对照组的表达较模型对照组明显减弱(P＜0.05),在针刺治疗组的表达较模型对照组明显减弱(P＜0.05),在针刺治疗组的表达较正常对照组增强(P＜0.05),而非穴位对照组与模型对照组之间相比较,Flotillin-1的表达水平无明显差异(P＞0.05);同时,Aβ42在正常对照组的表达较模型对照组明显减弱(P＜0.05),在针刺治疗组的表达较模型对照组明显减弱(P＜0.05),在针刺治疗组的表达较正常对照组增强(P＜0.05),而非穴位对照组与模型对照组之间相比较,Aβ42的表达水平无明显差异(P＞0.05);干预后,NEP在正常对照组的表达较模型对照组明显增强(P＜0.05),在针刺治疗组的表达较模型对照组明显增强(P＜0.05),在针刺治疗组的表达较正常对照组减弱(P＜0.05),而非穴位对照组与模型对照组之间相比较,NEP的表达水平无明显差异(P＞0.05)。详见表3及图4-5。

表3 各组小鼠海马组织Flotillin-1、NEP及Aβ42的western blot数据分析 (±s)

表3 各组小鼠海马组织Flotillin-1、NEP及Aβ42的western blot数据分析 (±s)

注:与正常对照组比较1)P＜0.05;与模型对照组比较2)P＜0.05;与非穴位对照组比较3)P＜0.05

正常对照组 2 0 0 . 7 9 0 ± 0 . 0 4 5 1 . 2 2 5 ± 0 . 0 5 0 0 . 7 2 6 ± 0 . 0 1 6模型对照组 2 0 1 . 2 9 3 ± 0 . 1 1 7 1) 0 . 7 7 4 ± 0 . 0 1 3 1) 1 . 0 8 3 ± 0 . 0 1 2 1)非穴位对照组 2 0 1 . 1 9 7 ± 0 . 0 1 1 1) 0 . 7 5 7 ± 0 . 0 1 1 1) 1 . 0 9 1 ± 0 . 0 0 7 1)针刺治疗组 2 0 1 . 0 1 2 ± 0 . 0 1 0 1)2)3) 0 . 8 4 6 ± 0 . 0 1 5 1)2)3) 1 . 0 5 9 ± 0 . 0 1 2 1)2)3)

图4 Flotillin-1、NEP及Aβ42在各组小鼠海马组织中的表达

图5 Flotillin-1、NEP及Aβ42在各组小鼠海马组织的western blot分析结果

3 讨论

阿尔茨海默病患者一个特征性神经病理表现就是脑实质中大量老年斑的形成,而老年斑的主要成分就是Aβ,Aβ主要是由其前体蛋白APP在β和γ分泌酶的作用下生成Aβ40、Aβ42,Aβ42易于形成具有AD特征的致密纤维状神经炎块斑,神经毒性较强。过多的 Aβ生成超其清除能力,导致 Aβ的绝对数量过多,不断沉积细胞外间隙中,沉积的 Aβ纤维不断聚集,继而引发复杂的瀑布样级联反应,包括氧化应激、神经递质丢失、Tau蛋白磷酸化、神经炎症反应、神经元凋亡、细胞结构的破坏、金属离子代谢紊乱等,这些反应可以导致一系列病理损伤,如淀粉样斑块的形成、神经元纤维缠结等,从而造成神经元的变性和功能障碍,最终导致AD的发生[10]。

APP的异常代谢途径正是在脂筏上进行的,脂筏是膜脂双层内含有特殊脂质及蛋白质的微区,聚集着许多蛋白质,为它们之间发生相互作用提供了平台。研究发现脂筏在淀粉样蛋白的生物起源和积累中发挥重要作用,这意味着脂筏在AD的发病机制中发挥重要作用[11-14]。脂筏参与了各种细胞活动,诸如细胞信号转导、分子的识别、跨膜转运等。脂筏蛋白(Flotillin-1)作为脂筏的主要组成成分和标记物,可以为 APP生成Aβ提供平台。研究表明APP顺序性酶切生成Aβ的异常代谢过程正是在脂筏上进行的[15],也就是说脂筏是APP生成Aβ的工作平台。Flotillin-1与AD的发病关系密切,研究发现其在 AD患者含有β淀粉样蛋白沉积的脑组织中表达明显增强,并且表达强度和 Aβ的沉积程度成正比关系[16],可能是 Flotillin-1表达增强使APP生成Aβ的工作平台增多从而导致Aβ产生过多。

NEP是位于轴突和突触膜的Ⅱ型跨膜糖蛋白,广泛分布于全身各组织。在脑中,特别是在易于发生 Aβ沉积的脑区如海马、大脑皮质、上丘脑、下丘脑、杏仁核和中央灰质部位,NEP存在较多。NEP为细胞降解Aβ的主要酶,降解不溶性Aβ,因此,NEP被称为脑内Aβ的清道夫[17]。有研究显示NEP亚细胞定位与Aβ生成及降解部位相一致,NEP对 Aβ的降解可能发生在突触或突触附近及轴浆运输的分泌小泡中[18]。大量研究表明,NEP是体内催化 Aβ降解的关键酶,是调节大脑 Aβ水平的重要因素。

本实验研究表明,补肾活血针刺法能够通过降低AD模型小鼠SAMP8小鼠海马组织中Flotillin-1、上调NEP的表达来促进Aβ的降解,从而减少Aβ的沉积,下调 Aβ42的表达,具有减轻其神经毒性作用,并能发挥神经保护作用。

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Effect of Acupuncture on Hippocampal Flotillin-1, NEP and Aβ42 Expressions in SAMP8 Mice

LI Guang-chen,LONG Cong,ZHU Hong,DONGKe-li,REN Dan,LIANGMei-ting,LIYa-yue.Department of Traditional Chinese Medicine,Central South University Third Xiangya Hospital,Changsha410013,China

ObjectiveTo investigate the effect of acupuncture on behaviors and its mechanism of action in a SAMP8 mouse model of Alzheimer disease.MethodsSixty 6-month-old male SAMP8 mice were randomized to acupuncture, model and non--acupoint groups. Twenty male SAMP1 mice of the same age constituted a normal control group. The acupuncture group

intervention by acupuncture at Shenshu, Baihui, Xuehai and Geshu. After eight weeks, a behavioral test was performed using the Morris water maze in every group of mice. The expressions of Flotillin-1, NEP and Aβ42 in mouse hippocampus were determined by western blot.ResultsThe Morris water maze test showed that as compared with the model group, escape latency shortened significantly (P＜0.05) and the time spent in the former platform quadrant and the number of former platform position crossings increased (P＜0.05) in the acupuncture group of mice; escape latency, the time spent in the former platform quadrant and the number of former platform position crossings had no significant differences in the non-meridian-acupoint group of mice (allP＞0.05). As compared with the model group, Flotillin-1 expression decreased significantly in the acupuncture group (P＜0.05) but had no significant difference in the non-meridian-acupoint group (P＞0.05); NEP expression increased significantly in the acupuncture group (P＜0.05) but had no significant difference in the non-meridian-acupoint group (P＞0.05); Aβ42 expression decreased significantly in the acupuncture group (P＜0.05) but had no significant difference in the non-meridian-acupoint group (P＞0.05).ConclusionsAcupuncture can markedly improve learning and memory abilities in a SAMP8 mouse model of AD and reduce Flotillin-1 content and upregulate NEP expression in SAMP8 mouse hippocampus to decrease Aβ42 expression, relieve neurotoxicity and produce a neuroprotective effect.

Acupuncture therapy; Alzheimer disease; SAMP8; Mice; Dementia

1005-0957(2017)11-1356-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.11.1356

国家自然科学基金青年基金项目(81202730);湖南省自然科学基金项目(2011JJ3097);中央高校基本科研业务经费项目(2012QNZT162);湖南省中医药科技项目(201413)

李广诚(1968—),男,副主任医师,博士,Email:x7080@126.com

朱宏(1981—),男,主治医师,博士,Email:yellingu@163.com

2017-05-06