温针灸对类风湿关节炎大鼠关节软骨vimentin蛋白的影响

蔡国伟,彭锐,李佳,李静

(1.华中科技大学同济医学院附属协和医院,武汉 430022;2.湖北中医药大学针灸骨伤学院/针灸治未病湖北省协同创新中心,武汉 430061)

温针灸对类风湿关节炎大鼠关节软骨vimentin蛋白的影响

蔡国伟1,彭锐2,李佳2,李静1

(1.华中科技大学同济医学院附属协和医院,武汉 430022;2.湖北中医药大学针灸骨伤学院/针灸治未病湖北省协同创新中心,武汉 430061)

目的探讨温针灸对类风湿关节炎(RA)大鼠关节软骨vimentin蛋白的影响以及对炎性因子的调节作用。方法将40只SD大鼠(雌雄各半)随机分为正常组、模型组、针刺组和温针灸组,每组10只。采用皮内注射牛Ⅱ型胶原接种诱发制备大鼠RA模型,共21 d。温针灸组于造模第1天取足三里、肾俞和悬钟穴进行温针灸(手针配合悬灸)治疗,针刺组采用单纯针刺治疗,共治疗 21 d。所有大鼠于相应处理结束后,采用排水法测大鼠膝关节部体积,放免法检测血清炎性因子IL-1β和IL-4含量,免疫组化法检测膝关节滑膜组织vimentin蛋白的表达。结果与正常组相比,模型组大鼠膝关节肿胀明显,血清中炎性因子IL-1β含量较高,IL-4含量较低,膝关节滑膜组织 vimentin蛋白表达升高,差异均具有统计学意义(P＜0.01);与模型组相比,针刺组和温针灸组大鼠膝关节肿胀改善明显,炎性因子IL-1β含量减少,IL-4含量升高,vimentin蛋白表达降低,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。与针刺组相比,温针灸组大鼠膝关节肿胀改善程度较好,血清中炎性因子 IL-1β含量显著降低,IL-4含量显著升高,膝关节滑膜组织vimentin蛋白表达增加,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。结论温针灸能有效调节RA大鼠关节炎性损伤状况,降低RA大鼠血清炎性因子和骨关节滑膜组织viemtnin蛋白表达,这可能是温针灸通过调节vimentin蛋白改善RA炎性损伤的调节机制之一,同时温针灸治疗RA疗效优于针刺治疗。

针灸疗法;关节炎,类风湿;温针疗法;针刺;波形蛋白

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种退行性病变,以慢性、进行性、侵袭性关节炎为主要表现,患者临床大多表现为关节疼痛和关节肿胀、畸形以及功能活动受限。随着社会老龄化进程日趋加剧,骨关节炎发病率逐年增加,已经演变成为严重的社会问题,值得广泛关注。然而其发病机制尚未完全阐明。骨关节炎的临床治疗经过几十年的探索,尽管有了许多治疗理念,但仍未找到一种能彻底阻断骨关节炎的发展进程的治疗方式[1]。温针灸治疗 RA历史悠久,早期介入治疗RA可以起到疏经通络、疏风散寒、利湿止痛等作用,从而阻止病情的发展。早期已有研究证明温针灸治疗该病的有效性,并受到医疗界的广泛认可,值得临床上推广运用[2-3]。

针灸是近年来临床应用较多的,疗效显著,但其作用机制有待于阐明。大量临床资料显示,采用多种针灸治疗方法,如针刺[4]、蜂针[5]、温针[6]、麦粒灸[7]、电热灸等治疗骨关节疾病获得较为满意的疗效,研究从不同角度发现针灸治疗能促进软骨的代谢水平和炎性物质的吸收,抑制关节液中的白介素类细胞因子水平以及滑膜组织一氧化氮的过度生成,从而减轻关节软骨病变。然而,针灸对RA病理过程中软骨细胞的调节作用以及抑制炎症反应的机制究竟如何,目前仍未完全阐明。因此,本研究希望在既往研究基础上,从RA大鼠关节软骨细胞vimentin蛋白的表达变化入手,进一步探讨温针灸对 RA大鼠软骨细胞骨架蛋白调控作用的可能机制,并比较温针灸方法和针刺方法的疗效差异,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

40只清洁级 3月龄 SD大鼠,雌雄各半,体重为(211±5.7)g,由湖北省医学科学研究院实验动物中心提供[SCXK(鄂)2004-0007号]。动物喂养在湖北中医药大学针灸研究所实验室完成,环境温度 21℃～25℃,湿度为40%～60%。光照时间每日12 h,大鼠可自由摄食饮水。本实验严格按照科技部[(2006)398号]《关于善待实验动物的指导性意见》文件要求进行实验。将40只SD大鼠随机分为正常组、模型组、针刺组和温针灸组,每组10只。

1.2 主要试剂及仪器

牛Ⅱ型胶原蛋白-溶液(美国SouthernBiotech公司);Vimentin抗体(美国Abcam公司);放射免疫分析试剂盒(北方生物技术研究所)。

0.30 mm×15 mm华佗牌毫针(苏州医疗用品厂有限公司);Axiovert 40CFL显微镜(德国 ZWISS); HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统(武汉千屏影像技术有限公司);Gc911放射免疫γ计数器(中国科技大学中佳公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备[8]

取适量牛Ⅱ型胶原溶于 0.5 mol/L乙酸中(2 mg胶原/mL),在 4℃下过夜溶化,再与等量弗氏不完全佐剂在冰浴下充分乳化制成乳剂。在 10%戊巴比妥钠腹腔麻醉(100 g/0.3 mL)下,每只大鼠每日以0.1 mL乳剂(200 μg胶原),在足底部作皮内注射接种诱发,连续21 d,关节病变程度以排水法测足部体积评估。

1.3.2 分组治疗

温针灸组治疗时,为便于操作,需固定动物,大鼠穿自制鼠衣,参照中国针灸学会实验针灸研究会制定的“实验动物针灸穴位图谱”取双侧足三里、肾俞和悬钟穴。采用0.30 mm×15 mm毫针进行针刺,针刺深度约为5 mm,强度以大鼠耐受为度,然后用特制香烟型纯艾条离穴位2 cm处进行悬灸。每日1次,每次15 min,治疗从造模后第1天开始至第21天结束,共21次。针刺组于造模同时给予针刺治疗,针刺方法同温针灸组,不使用艾灸治疗。其余两组大鼠采用常规饲养。

1.4 观察指标

1.4.1 足部体积

采用排水法测量大鼠足部体积[9],将大鼠足部插入灌满水的特制量筒,在水面与膝关节上2 cm处持平,另用一个烧杯接从量筒侧口排出的水,排出水的体积即为所测大鼠足跖部的体积。分别测量第1、3、7、14天排水体积,每只大鼠每次分别测量3次,取其均值。

1.4.2 IL-1β和IL-4含量

相应处理结束,大鼠于第21天行腹腔麻醉(10%戊巴比妥钠,100 g/0.3mL)后心内采血,所采血液于洁净干燥 EP管内静置 1 h后,上离心机分离血清(3000 rpm,10 min),即得血清,再采用放免法检测 IL-1β和IL-4含量,实验操作同前[10]。

1.4.3 免疫组化法

实验操作步骤同前[11],关节软骨组织切片的制备操作如下,大鼠经腹腔麻醉后迅速开胸暴露心脏,先用4℃ 0.9%氯化钠溶液250 mL快速冲管,再灌注4℃ 4%多聚甲醛溶液 500mL,先以 150 mL快速灌注,再以350 mL缓慢滴注。灌注结束后打开大鼠膝关节腔,于股骨髁上约5 cm处截取股骨,于胫骨平台下3 mm截取胫骨,小心取下膝关节,去除周围软组织后剪开髌骨两侧腱膜,将髌骨向下翻转,打开膝关节,手术刀削取关节软骨组织修块后入 4%多聚甲醛溶液固定过夜,24 h内行常规固定,脱钙,石蜡包埋,切片。运用免疫组化SABC法检测关节软骨中 vimentin蛋白的表达,采用Axiovert 40CFL显微镜和HPIAS-2000彩色病理图像分析系统进行图像采集和分析,测量vimentin阳性反应物平均光密度(MOD),每组切片的每个部位测3个视野,100倍镜下检测各片的MOD值,分别测定,累加取均值。

1.5 统计学方法

所有数据采用SPSS18.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示,组间比较运用单因素方差分析,组间两两比较,方差齐性时采用LSD检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清IL-1β和IL-4含量比较

RA模型大鼠血清中IL-1β含量较正常大鼠明显增加(P＜0.01),IL-4含量减少(P＜0.01);针刺和温针灸均能降低大鼠血清中IL-1β含量和提高IL-4水平,与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05);与针刺组相比,温针灸组大鼠血清中 IL-1β含量降低更为显著,而IL-4水平偏高,差异具有统计学意义(P＜0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠血清IL-1β和IL-4含量比较(±s,ng/mL)

表1 各组大鼠血清IL-1β和IL-4含量比较(±s,ng/mL)

注:与正常组比较 1)P＜0.01;与模型组比较 2)P＜0.05;与针刺组比较3)P＜0.05

组别 n IL-1β IL-4正常组 10 22.24±5.26 79.28±5.02模型组 10 55.17±5.121) 35.33±4.371)针刺组 10 44.27±2.672) 52.17±5.112)温针灸组 10 37.84±8.262)3) 61.74±4.462)3)

2.2 各组大鼠膝关节关节软骨组织vimentin蛋白表达比较

免疫组化检测显示,vimentin蛋白在软骨组织中广泛表达,呈深棕色。模型组大鼠vimentin表达最高,与正常组比较,差异具有显著性(P＜0.01);与模型组比较,针刺组和温针灸组vimentin蛋白表达水平降低,差异具有显著性(P＜0.05);与针刺组比较,温针灸组vimentin蛋白表达水平降低,表达差异具有显著性(P＜0.05)。详见表2、图1。

表2 各组大鼠膝关节关节软骨组织vimentin蛋白表达比较 (±s,%)

表2 各组大鼠膝关节关节软骨组织vimentin蛋白表达比较 (±s,%)

注:与正常组比较 1)P＜0.01;与模型组比较 2)P＜0.05;与针刺组比较3)P＜0.05

组别 n vimentin蛋白表达正常组 10 100.24±18.26模型组 10 241.17±35.161)针刺组 10 196.05±22.332)温针灸组 10 170.34±25.682)3)

图1 各组免疫组化检测(×100)

2.3 各组大鼠关节肿胀程度比较

21 d模型制备过程中,除正常组大鼠外,其余各组大鼠第3天关节肿胀程度显著高于正常组(P＜0.01),其中模型组大鼠关节肿胀程度最为显著;针刺和温针灸治疗后,关节肿胀程度变小,于第12天开始,与模型组比较有显著性差异(P＜0.05);针刺组与温针灸组之间比较,于第 15天开始呈现显著性变化,差异具有统计学意义(P＜0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠不同时间关节肿胀程度比较 (n=10)(±s,mm3)

表3 各组大鼠不同时间关节肿胀程度比较 (n=10)(±s,mm3)

注:与正常组比较1)P＜0.01;与模型组比较2)P＜0.05;与针刺组比较3)P＜0.05

组别 造模前 造模第3天 造模第6天 造模第9天 造模第12天 造模第15天 造模第18天 造模第21天正常组 1.20±0.04 1.22±0.05 1.23±0.04 1.26±0.04 1.28±0.05 1.30±0.03 1.32±0.04 1.32±0.06模型组 1.21±0.04 1.78±0.261) 1.75±0.231) 1.68±0.181) 1.70±0.151) 1.80±0.171) 2.02±0.201) 2.20±0.191)针刺组 1.21±0.05 1.79±0.251) 1.75±0.221) 1.72±0.201) 1.67±0.141)2) 1.64±0.151)2) 1.82±0.181)2) 1.68±0.141)2)温针灸组 1.20±0.05 1.81±0.281) 1.76±0.261) 1.63±0.171) 1.61±0.181)2) 1.55±0.131)2)3) 1.64±0.151)2)3) 1.60±0.151)2)3)

3 讨论

类风湿关节炎是一种多好发于手、足、腕等小关节的慢性炎症疾病,早期临床症状主要有关节肿胀热痛及功能障碍,晚期则表现为关节僵硬,致残率非常高[12-13]。患者往往晨起疼痛加重,并伴有晨僵,且疼痛发作时,伴随关节无力、肌肉萎缩等表现。美国疾病与控制中心早已报告,与RA相关的生活时间风险评估在女性中占4%,男性占3%[14]。由于不能获得有效的药物来治疗 RA,因此只能使用对症药物如甲氨蝶呤、萘普生、免疫抑制剂(环磷酰胺)等来减缓症状和减轻关节残疾。然而,这些药物具有各种副反应,如胃肠道不适、溃疡、肾毒性、肝毒性等[15]。考虑到西药治疗本病毒副反应大且易产生耐药性的弊端,使用针灸的方法显得更为经济及有效。

RA属中医学“尪痹”“痹证”范畴,此乃脾胃虚弱,阳气不足,卫外无力,风寒湿火等毒邪入侵,流于经络,机关不利所致。古代医家很早就对本病作了详细的研究,《诸病源候论》:“痹者,风寒湿三气杂至,合而成痹……病在阳曰风,在阴曰痹,阴阳俱病曰风痹。”《济生方·痹》:“皆因体虚,腠理空疏,受风寒湿气而成痹也。”脾胃健实,则正气存内,邪不可干,病久脾胃虚弱,气血不足,肝肾阴虚,故针灸治疗原则为补肾益气,温经通络除湿,标本兼治。足三里为多气多血之足阳明经合穴,有调理脾胃、通畅气机、通经活络之功效;肾俞穴能补肾气、益阴阳、强腰健骨;悬钟乃髓会,胆经之穴,主骨所生病。三穴配伍,共奏补益先天与后天之功效,配合局部取穴,可疏通经络,祛邪外出,最终达到正胜邪退之目的,从而改善症状。

RA作为一种免疫性疾病,其特征在于滑膜的慢性炎症,血管形成增加、骨侵蚀和炎性细胞浸润。应用广泛且较为成熟的动物模型是胶原诱导性关节炎(CIA)和佐剂性关节炎(AA),均为较理想的模型。但AA与CIA模型相比,AA模型的病理切片中主要表现为大量炎性细胞浸润,滑膜增生和软骨破坏等现象不如 CIA模型明显,并且缺乏慢性病理过程。CIA大鼠的免疫功能变化兼有体液免疫和细胞免疫的优点,体内可检出针对自身Ⅱ型胶原的高滴度的IgG抗体,与人类RA免疫变化相似[15]。故CIA模型更接近于人类RA的临床特点、病理表现及免疫改变,成为研究 RA的经典动物模型。1977年Trentham DE等[16]首次发现Ⅱ型胶原,并成功诱导了RA模型SD大鼠。近年来的研究逐渐证明,平滑肌肌动蛋白聚合和解聚、细胞骨架波形蛋白vimentin的重组,平滑肌细胞收缩动力学过程与这两种功能的行使有密不可分的关系[17-19]。而且我们最近的研究[20-21]也发现,平滑肌细胞骨架调节蛋白引起vimentin的磷酸化从而影响该蛋白的重组,进而调节平滑肌细胞收缩[22-23]。但之前对其在炎症方面的作用研究较少,有实验表明,波形蛋白能够影响调控平滑肌细胞炎性小体形成及活性[24]。Vimentin通过不同途径调控着细胞多种功能,与类风湿关节炎、白内障、丙型肝炎以及肿瘤的发生发展相关[25]。目前大多数研究人员认为免疫异常及感染因子参与 RA的发病[26]。IL-4作为Th2细胞的特征细胞因子,在以Th2为特征的炎症反应中有促进其发生发展的作用。Lübbers J等[27]认为局部IL-4治疗可阻止关节损伤和骨侵蚀,这种保护作用与破骨样细胞形成因子IL-17、IL-6、IL-12以及关节炎骨蛋白整合素下调有关。IL-1β是一种具有广泛生物学活性的促炎性细胞因子,可以调节多种细胞因子、细胞黏附分子、免疫调节分子和前炎性介质的表达。在多种疾病的发生发展中发挥着重要作用。已有研究[28]发现,IL-1β基因多态性影响疾病对治疗的反应。IL-1β是参与RA滑膜炎症和软骨、骨破坏的主要炎性介质,血清 IL-l的水平与RA的活动性及组织形态学特征密切相关。

本实验研究结果提示,RA模型组关节肿胀明显,表明皮下注射牛Ⅱ型胶原蛋白造成大鼠骨关节炎性损伤。温针灸组能够显著降低骨关节肿胀指数以及血清IL-1β水平,提高 IL-4表达,从而改善关节炎损伤状况。模型组与正常组相比,膝关节中vimentin在软骨组织中表达变化异常,提示骨架蛋白vimentin参与了RA的发生。因此,本研究认为有效调节该蛋白可以有效抑制RA炎性损伤的发生。同时本实验发现针刺或温针灸干预下的膝关节软骨组织vimentin表达减少,并且温针灸效果更佳,提示温针灸足三里、肾俞和悬钟穴能够调节蛋白 vimentin,这可能是其抗类风湿的新机制。但是温针灸通过怎样的途径来调节该蛋白,目前尚不清楚,须进一步研究。

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Effect of Warm Needling Moxibustion on Articular Cartilage Vimentin in Rats with Rheumatoid Arthritis

CAI Guo-wei1,PENGRui2,LIJia2,LIJing1. 1.Huazhong University of Science and Technology Tongji Medical School Union Hospital,Wuhan430022,China; 2.Hubei University of Traditional Chinese Medicine School of Acupuncture and Traumatology/Hubei Collaborative Innovation Center of Acupuncture Prevention Treatment of Diseases,Wuhan430061,China

ObjectiveTo investigate the impact of warm needling moxibustion on articular cartilage vimentin and the regulating effect on inflammatory factors in rats with rheumatoid arthritis (RA).MethodsForty SD rats (half male and half female) were randomized to normal, model, acupuncture and warm needling moxibustion groups, 10 rats each. A rat model of RA was made by intradermal injection of bovine type Ⅱ collagen for 21-day inoculation inducement. At one day after model making, the warm needling moxibustion group was treated with warm needling moxibustion on points Zusanli, Shenshu and Xuanzhong (manual needling plus suspended moxibustion) and the acupuncture group, with acupuncture alone, for a total of 21 days. In all the rats after the completion of corresponding treatments, knee joint volume was measured by drainage, serum inflammatory factors IL-1β and IL-4 contents were determined by radioimmunology and the expression of vimentin in knee joint synovium was examined by immunehistochemical method.ResultsAs compared with the normal group, knee joint swelling was marked, serum inflammatory factors IL-1β and IL-4 contents were higher and the expression of vimentin in knee joint synovium increased in the model group of rats. There were statistically significant differences (P＜0.01). As compared with the model group, knee joint swelling improved markedly, inflammatory factor IL-1β content decreased, IL-4 content increased and vimentin expression decreased in the acupuncture and warm needling moxibustion groups of rats. There were statistically significant differences (P＜0.05). As compared with the acupuncture group, knee joint swelling improved more, serum inflammatory factor IL-1β content decreased significantly, IL-4 content increased significantly and the expression of vimentin in knee joint synovium increased in the warm needling moxibustion group of rat. There were statistically significant differences (P＜0.05).ConclusionsWarm needling moxibustion can effectively reduce articular inflammatory injury and decrease serum inflammatory factors and the expression of vimentin in knee joint synovium in RA rats. Regulating vimentin may be one of the mechanisms by which warm needling moxibustion reduce RA inflammatory injury. Warm needling moxibustion is more effective than acupuncture in treating RA.

Acupuncture-moxibustion therapy; Arthritis, rheumatoid; Warm needling moxibustion; Acupuncture; Vimentin

1005-0957(2017)11-1361-06

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.11.1361

国家自然科学基金项目(81403485,81774410);湖北省自然科学基金项目(2016CFB221;2015CKB745)

蔡国伟(1964—),男,主任医师,硕士生导师,Email:cgw645@163.com

李静(1982—),女,主治医师,博士,Email:461688459@qq.com

2017-06-02