紫光分光光度法和高效液相色谱法测定百令胶囊中D—甘露醇含量的比较

王心珉

【摘要】 目的 探讨紫光分光光度法和高效液相色谱法测定百令胶囊中D-甘露醇含量的差异。方法 采用紫光分光光度法和高效液相色谱法测定百令胶囊中D-甘露醇含量， 并比较不同方法测定的D-甘露醇含量。结果 紫光分光光度法测定的D-甘露醇含量为（6.03±0.35）mg/g， 显著低于高效液相色谱法的（6.52±0.35）mg/g， 差异有统计学意义（P<0.05）。紫光分光光度法测定的D-甘露醇含量与高效液相色谱法呈正相关（r=0.965， P=0.002<0.05）。结论 高效液相色谱法的灵敏度、稳定性、准确度、重复性均优于紫光分光光度法， 但紫光分光光度法操作比较简单， 对试剂的要求较低， 不需要特定标准品， 经济、快速， 故更适用于百令胶囊中D-甘露醇的日常定量检测。

【关键词】 紫光分光光度法；高效液相色谱法；百令胶囊；D-甘露醇

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.31.114

百令胶囊是《中国药典》收载的药品， 是人工发酵冬虫夏草菌粉所得菌丝体而制成的胶囊， 其有效成分为19种氨基酸、D-甘露醇、生物碱、维生素及微量元素等， 具有补肺肾、益精气及止咳化痰作用[1]， 主要用于治疗慢性肾衰、IgA肾病、肾小球肾炎、肾小管损伤、肾移植、2型糖尿病伴微量白蛋白尿、反复发作性尿路感染、肝疾病、呼吸系统疾病等[2]。有研究显示， 百令胶囊可通过抑制炎症因子白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）， 并增加可溶性细胞间粘附分子-1（sICAM-1）的表达， 抑制淋巴细胞增殖， 具有双向免疫调节作用[3]。还有研究表明， D-甘露醇即虫草酸是真菌类药物的主要成分之一， 具有利尿脱水、镇咳祛痰平喘、降脂等功效， 并且也是人工冬虫夏草的主要质控指标[4]。本研究通过紫光分光光度法和高效液相色谱法测定D-甘露醇的含量， 并比较两种方法的准确度， 为该药物的质控提供参考。

1 材料与方法

1. 1 仪器与试剂 主要仪器包括高效液相色谱仪（Waters系列）、UV-2000紫光可见分光光度计、电子天平（BP121S）、恒温水浴锅、混匀器、清洗器。主要试剂包括百令胶囊（购自中美华东制药有限公司）、D-甘露醇对照品、高碘酸钠、乙醇、硫酸、碘化钾、L-鼠李糖、乙酰丙酮、醋酸铵、冰醋酸。

1. 2 方法

1. 2. 1 主要试剂溶液的制备 ①0.1% L-鼠李糖溶液的制备：称取L-鼠李糖0.1 g于100 ml的容量瓶中， 加蒸馏水定容至100 ml， 混匀， 待用。②0.015 mol/L的高碘酸钠溶液的制备：称取0.321 g高碘酸钠溶于0.12 mol/L的盐酸溶液中， 定容至100 ml， 混匀， 待用。③Nash试剂的制备： 取75 g醋酸铵、1 ml冰醋酸、1 ml乙酰丙酮加蒸馏水定容至500 ml。

1. 2. 2 对照品溶液的制备 称取D-甘露醇对照品0.05 g于50 ml锥形瓶中， 加蒸馏水定容至100 ml， 加热使之溶解， 摇匀， 放置冰箱内冷藏， 待用。

1. 2. 3 样品溶液的制备 将百令胶囊粉末筛后， 称取0.3 g样品至50 ml具塞锥形瓶中， 加入25 ml乙醇， 称重， 加热回流2 h， 冷却， 用乙醇不足重量， 摇匀过滤， 取25 ml滤液进行干燥， 残渣用流动相加热转溶至容量瓶中， 冷却， 加蒸馏水定容至25 ml， 即得。

1. 2. 4 空白溶液的制備 步骤同“1.2.3”， 加入25 ml乙醇至50 ml具塞锥形瓶中， 称重， 加热回流2 h， 冷却， 用乙醇不足重量， 摇匀过滤， 取25 ml滤液进行干燥， 残渣用流动相加热转溶至容量瓶中， 冷却， 加蒸馏水定容至25 ml， 即得。

1. 3 紫光分光光度法

1. 3. 1 吸光度值的测定 吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml对照品溶液分别置于容量瓶中， 加入蒸馏水定容至100 ml， 混匀， 再各吸取1 ml置于试管中， 分别加入 0.015 mol/L的高碘酸钠溶液1 ml， 放置10 min， 加入0.1% L-鼠李糖溶液， 最后加入4 ml Nash试剂， 摇匀， 在恒温水浴箱中加热15 min， 然后冷却， 以蒸馏水作为空白溶液， 在412 nm处测定D-甘露醇对照品的吸光度值。

1. 3. 2 样品D-甘露醇含量的测定 根据“1.3.1”测得吸光度值的操作及标准曲线， 吸取样品溶液1 ml进行测定吸光度值， 并根据标准曲线回归方程（Y=0.0431X+0.0033， Y为吸光度值， X为D-甘露醇对照品溶液浓度）计算样品中D-甘露醇含量。

1. 4 高效液相色谱法

1. 4. 1 色谱条件 色谱柱：Waters sugar-pak-1钙型（300 mm×6.5 mm）， 流动相：甲醇-0.05 mol/L磷酸氢二钠溶液（17∶83）， 流速1.0 ml/min， 柱温：室温， 进样量：10 ?l。

1. 4. 2 样品D-甘露醇含量的测定 吸取样品溶液10 ?l， 根据“1.4.1”所设定的色谱条件注入高效液相色谱仪进行测定， 记录峰面积值， 因本样品为干燥品， 故采用外标法计算样品中D-甘露醇的含量， 公式为：CX=CR（AX/AR）， 其中CX为供试品的含量， CR为对照品的含量， AX为供试品的峰面积或峰高， AR为对照品的峰面积或峰高。

1. 5 统计学方法 采用SPSS13.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；相关性采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 不同方法测定百令胶囊D-甘露醇含量的比较 紫光分光光度法测定的D-甘露醇含量为（6.03±0.35）mg/g， 显著低于高效液相色谱法的（6.52±0.35）mg/g， 差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。endprint

2. 2 不同方法测定百令胶囊D-甘露醇含量的相关性分析 紫光分光光度法测定的D-甘露醇含量与高效液相色谱法呈正相关（r=0.965， P=0.002<0.05）。见图1。

3 讨论

冬虫夏草是我国传统药用真菌， 有2000多年的历史， 是三大瑰宝之一， 具有免疫调节、抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗菌、抗炎等作用， 对心、肝、肺、肾、中枢神经系统、免疫系统等具有保护作用[5]。但因其受自然条件的限制， 产量较低， 价格比较昂贵， 无法在临床上推广使用， 故在1983年沈南英等从青海省玉树及化隆的冬虫夏草上分离及培养中华束丝孢， 即为百令胶囊[6]。大部分研究均已证实， 百令胶囊具有以下作用：①免疫调节作用：主要是通过抑制抗原递呈细胞的功能， 阻断外来信号刺激的呈递， 影响树突细胞刺激增殖的能力， 出现免疫抑制。②抗氧化作用：主要是通过激活单核巨噬细胞T、B淋巴细胞和NK细胞来阻止自由基和脂质过氧化的损伤。③抗纤维化作用：主要是通过抑制一些促纤维化因子的表达来抑制胶原及细胞外基质的生成。④保护肾功能：主要包括减少尿蛋白， 保护肾小管细胞Na+-K+-ATP酶， 促进肾小管细胞增殖及细胞修复， 抑制肾小球的代偿性肥大。⑤抗炎作用：主要是通过抑制炎症因子水平， 纠正Th1/Th2失衡。⑥辅助治疗肿瘤：百令胶囊中含有的多肽或蛋白质、核苷类衍生物、多糖类等能有效抑制肿瘤细胞生长， 增强放化疗的耐受性及减轻毒性[7-9]。

D-甘露醇的测定方法较多， 常用的主要有高碘酸盐氧化法、旋光法、折光法、比重法、分光光度法、高效液相色谱法等， 其中高碘酸盐法的重现性和准确度较好， 但操作比较复杂、费时， 对操作者的要求较高；旋光法、折光法操作比较简单、准确、方便；比重法虽然操作简单准确， 但比较费时， 这几种方法容易受到实验室的温度、溶剂、仪器性能等因素的干扰， 导致结果不准确， 并且均适用于测定纯甘露醇含量[10-12]。紫光分光光度法是指在特定波长处或一定波长范围内光的吸光度， 对待测定物质进行定性和定量分析的方法， 操作比较简单、方便、准确、快捷， 可适用于甘露醇的混合物的检测， 能够排除样品中的其他还原物质的干扰， 能够测定D-甘露醇的实际含量。而高效液相色谱法是以液体为流动相， 采用高压输液系统， 将流动相泵入装有固定相的色谱柱， 在柱内各成分被分离后， 进入检测器， 对试样进行分析， 操作比较复杂， 准确， 稳定性较好， 专属性强， 但在溶液制备过程中应以流动相制备对照品和样品溶液， 以减少其他溶剂对待测成分折光率的影响， 此外还需要控制柱温和室温， 以免影响折光率。大部分研究显示， 高效液相色谱法中流动相的比例是影响D-甘露醇分离度的主要因素， 本研究采用甲醇-0.05 mol/L磷酸氢二钠溶液（17∶83）流动相可使D-甘露醇色谱峰与其他峰完全脱离， 达到较好的分离效果， 能够测定D-甘露醇的实际含量[13]。故本研究针对紫光分光光度法和高效液相色谱法这两种方法测量百令胶囊中D-甘露醇的含量进行比较。

有研究采用高效液相色谱-蒸发光散射检测（HPLC-ELSD）法测定百令胶囊中甘露醇的含量， 结果显示， 甘露醇含量为10.00～27.60 mg/g， 平均17.3973 mg/g[14]， 高于本研究两种方法测定甘露醇的含量。还有研究采用高效液相色谱-示差折光检测（HPLC-RID）法和滴定法测定百令胶囊中甘露醇的含量[15]， 结果显示， HPLC-RID测定的含量为5.94～7.29 mg/g， 与本研究结果基本一致， 而滴定法为14.85～18.10 mg/g， 显著高于本研究结果。这说明HPLC-ELSD法和滴定法均不能测定甘露醇的实际含量， 可能测定的是所有还原性糖的含量， 故而测定的含量较高， 而HPLC-RID法采用以乙醇为溶剂， 加热回流提取甘露醇， 预处理比较简单， 分离度较高， 故可测定甘露醇的实际含量。本研究显示， 紫光分光光度法测定的D-甘露醇含量显著低于高效液相色谱法， 但相关性较好（r=0.965）。虽然两种方法均能测定甘露醇的实际含量， 但高效液相色谱法的灵敏度、稳定性、准确度、重复性均优于紫光分光光度法， 但考虑到紫光分光光度法操作比较简单， 对试剂的要求较低， 不需要特定标准品， 经济， 快速， 故适用于百令胶囊中甘露醇的定量检测。

综上所述， 高效液相色谱法能够更准确地测定百令胶囊中D-甘露醇的含量， 且灵敏度、稳定性、准确度、重复性均较高， 随着分析技术的不断發展， 高效液相色谱法的成本能够降低， 逐渐成为测定甘露醇含量的主要方法。但在日常检测中， 应充分了解两种方法的优、缺点， 结合实际情况选择使用两种方法， 保证百令胶囊的临床效果。

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