丁苯酞对大鼠脑缺血再灌注损伤后Bcl—2蛋白表达影响的研究

萨丽波+李宇

【摘要】 目的 觀察丁苯酞对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后Bcl-2蛋白表达的影响及其神经保护机制。方法 60只健康SD大鼠， 制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型， 造模成功2 h后拔除线栓， 再灌注， 将造模成功的SD大鼠随机分为丁苯酞治疗组、缺血再灌注组及假手术组， 每组20只。缺血再灌注组和假手术组按照150 mg/kg给予生理盐水， 丁苯酞治疗组在造模后2 h以同等剂量通过腹腔注射丁苯酞注射液。各组大鼠神经功能缺损评分均在麻醉苏醒后进行；在各组中各随机选取10只大鼠， 通过TTC染色观察脑梗死体积；各组余下大鼠进行免疫组化检测， 观察Bcl-2蛋白表达的变化。

结果 三组神经功能缺损评分、脑梗死体积比较差异均具有统计学意义（P<0.05）；缺血再灌注组及丁苯酞治疗组神经功能缺损评分、脑梗死体积均高/大于假手术组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。三组Bcl-2蛋白表达阳性率比较差异具有统计学意义（P<0.05）；缺血再灌注组及丁苯酞治疗组Bcl-2蛋白表达阳性率（20.12±3.36）%、（26.18±2.85）%均高于假手术组（3.15±0.42）%， 差异均具有统计学意义（P<0.05）；丁苯酞治疗组Bcl-2蛋白表达阳性率高于缺血再灌注组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 丁苯酞注射液对于大鼠缺血性脑损伤治疗有效， 可以减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的程度， 具有神经保护作用， 其作用机制可能与Bcl-2蛋白表达相关， 并能延长缺血再灌注治疗时间窗。

【关键词】 丁苯酞；脑缺血再灌注损伤；Bcl-2蛋白

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.31.113

【Abstract】 Objective To observe the effect of butylphthalide on the expression of Bcl-2 protein after cerebral ischemia reperfusion injury in rats and its neuroprotective mechanism. Methods A total of 60 healthy SD rats were used to prepare rat middle cerebral artery ischemia-reperfusion model. After 2 h of successful model， the suture was removed for reperfusion， and the successful model of SD rats were randomly divided into butylphthalide treatment group， ischemia reperfusion group and sham operation group， with 20 rats in each group. The ischemia reperfusion group and sham operation group was treated with normal saline and butylphthalide by 150 mg/kg， and butylphthalide treatment group received intraperitoneal injection of butylphthalide at the same dose 2 h after molding. The neurological deficit scores of all groups were performed after the recovery of anesthesia. 10 rats were randomly selected in each group， and the volume of cerebral infarction was observed by TTC staining. The remaining rats in each group were detected by immunohistochemistry， and the changes of Bcl-2 protein expression were observed. Results Three groups had statistically significant difference in neurological deficit score and cerebral infarction volume （P<0.05）. Ischemia reperfusion group and butylphthalide treatment group had higher/larger neurological deficit score and cerebral infarction volume than sham operation group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Three groups had statistically significant difference in positive rate of Bcl-2 protein expression （P<0.05）. Ischemia reperfusion group and butylphthalide treatment group had higher positive rate of Bcl-2 protein expression as （20.12±3.36）% and （26.18±2.85）% than （3.15±0.42）% in sham operation group， and their difference was statistically significant （P<0.05）. Butylphthalide treatment group had higher positive rate of Bcl-2 protein expression than ischemia reperfusion group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Butylphthalide injection is effective in treating ischemic brain injury in rats. It can reduce the degree of cerebral ischemia-reperfusion injury in rats and has neuroprotective effect. Its mechanism may be related to the expression of Bcl-2 protein and it also can prolong the time window of ischemia - reperfusion therapy.endprint

【Key words】 Butylphthalide； Cerebral ischemia reperfusion injury； Bcl-2 protein

近年来， 缺血性脑血管病发病率越来越高， 已经严重威胁人类的健康。研究表明， 丁苯酞可以阻断缺血性脑损伤的多个病理生理环节， 对缺血性脑血管病具有明确有效的治疗作用[1]。缺血性脑血管病的主要病理基础是脑缺血再灌注损伤， 而神经细胞凋亡是导致发病的主要机制之一。目前研究的热点是通过何种途径减轻神经细胞凋亡从而达到治疗的目的。本研究通过注射丁苯酞对大鼠局灶性脑缺血再灌注部位进行干预， 观察其疗效及对Bcl-2蛋白表达的影响， 分析丁苯酞治疗缺血性脑损伤的作用机制， 为临床治疗脑梗死提供理论基础。

1 材料与方法

1. 1 实验动物、药物与建立缺血再灌注模型 健康雄性SD大鼠60只， 平均体重（250±50）g， 购置于沈阳医学院动物实验中心。丁苯酞氯化钠注射液的提供单位是石药集团恩必普药业有限公司（批号：618170306）， 每100毫升注射液含丁苯酞25 mg与氯化钠0.9 g。根据Zea线栓法[2]制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型， 造模成功2 h后拔除线栓， 再灌注。将造模成功的SD大鼠随机分为丁苯酞治疗组、缺血再灌注组及假手術组， 每组20只。

1. 2 实验方法 缺血再灌注组和假手术组按照150 mg/kg给予生理盐水。丁苯酞治疗组在造模后2 h以同等剂量通过腹腔注射丁苯酞注射液， 各组大鼠神经功能缺损评分均在麻醉苏醒后进行。在各组中各随机选取10只大鼠， 通过TTC染色观察脑梗死体积；各组余下大鼠进行免疫组化检测， 观察Bcl-2蛋白表达的变化。

1. 3 观察指标及评定标准

1. 3. 1 神经功能评分 按Zea评分标准， 总分为4分， 评分标准：4分为不能行走且意识水平下降；3分为行走时左侧跌倒；2分为行走时向左侧转圈；1分为不能完全伸展左前肢；0分为正常， 无神经体征。于缺血再灌注24 h后对各组大鼠进行行为学评分记录。

1. 3. 2 脑梗死体积的测定（TTC染色法） 于缺血2 h再灌注24 h后将测脑梗死体积的大鼠处死， 断头取脑， 放置于-20℃冰箱固定30 min， 取冠状面均匀切成2 mm的脑片， 共5片， 将脑片放入盛1% TTC溶液中37℃避光孵育30 min， 利用Luxex-F病理图像分析仪对每个脑片的梗死面积及脑缺血侧半球面积进行分析处理， 并根据公式V=t（A1+A2+…An）-（A1+An）t/2计算出脑梗死体积和脑缺血侧半球体积， 用数码相机拍照， 输入计算机中。

1. 3. 3 免疫组化检测Bcl-2蛋白 各组在缺血后24 h， 丁苯酞治疗组、缺血再灌注组和假手术组随机10只大鼠， 用10%水合氯醛麻醉后断头取脑， 冠状切取厚约3 mm脑组织， 取大脑半球脑组织进行外固定， 最后进行脱水、透明、包埋、切片处理；免疫组化染色， DAB显色。在高倍光镜下观察Bcl-2阳性细胞数， 随机选择3个不重复的阳性细胞分布区， 计算Bcl-2阳性细胞的百分率。

1. 4 统计学方法 采用SPSS13.0统计学软件对研究数据进行分析处理。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 组间比较应用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

三组神经功能缺损评分比较差异具有统计学意义（P<0.05）；缺血再灌注组及丁苯酞治疗组神经功能缺损评分均高于假手术组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表1。三组脑梗死体积比较差异具有统计学意义（P<0.05）；缺血再灌注组及丁苯酞治疗组脑梗死体积均大于假手术组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表2。三组Bcl-2蛋白表达阳性率比较差异具有统计学意义（P<0.05）；缺血再灌注组及丁苯酞治疗组Bcl-2蛋白表达阳性率（20.12±3.36）%、（26.18±2.85）%均高于假手术组（3.15±0.42）%， 差异均具有统计学意义（P<0.05）；丁苯酞治疗组Bcl-2蛋白表达阳性率高于缺血再灌注组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见表3。

3 讨论

丁苯酞是我国首个在脑血管领域拥有自主知识产权的药物， 为人工合成的左旋消旋体， 其结构与芹菜籽中提取的左旋芹菜甲素的结构相同。其主要作用靶点在血管内皮， 具有抗血小板聚集、促进血管再生、抑制自由基的活性及改善神经功能缺损的作用。近年的多项临床试验表明， 丁苯酞可以促进脑缺血部位组织的血供， 改善脑组织微循环的血流， 对脑缺血具有有效的治疗作用[3-5]。其可能的作用机制包括清除自由基、抑制神经细胞凋亡、增加缺血区脑血流量、重构缺血区微循环和抑制细胞内钙超载等， 具有较强的抗缺血作用， 可明显减轻脑水肿、缩小脑梗死面积， 对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤具有保护作用， 改善脑能量代谢和缺血区的微循环和血流量[6]。

Czabotar等[7]研究发现细胞凋亡是脑缺血再灌注损伤进程中的重要的机制之一， 脑缺血再灌注损伤的程度与细胞凋亡的程度呈正相关。因此， 如果细胞凋亡的程度减轻， 脑组织缺血的损伤程度就可相应的减轻， 从而达到了神经保护的目的。Bcl-2蛋白是一种抗凋亡蛋白， 已经证实可以参与细胞凋亡的调节， 与其他的癌蛋白破坏细胞正常的增殖调控机制不同， Bcl-2蛋白的主要作用是抑制细胞凋亡。还有研究发现， Bcl-2蛋白高表达于线粒体膜， 可通过改变膜电位， 减少细胞色素C的释放等机制发挥抑制凋亡的作用[8]。Bcl-2的作用表达与神经细胞存活程度紧密相关， Volkmann等[9]研究表明增加脑内Bcl-2的表达可减少脑梗死灶体积， 从而起到神经保护作用， 在脑缺血再灌注后6 h后Bcl-2蛋白阳性细胞数量开始增加， 多数在24 h达高峰。本实验与上述结果相似， 丁苯酞治疗组可见Bcl-2阳性细胞的表达数量明显增加， 而大鼠脑缺血再灌注组在缺血24 h后， Bcl-2蛋白阳性细胞有一定的表达， 这说明Bcl-2蛋白参与了脑缺血再灌注的过程， 丁苯酞对脑缺血再灌注损伤的作用机制可能是通过增加缺血部位Bcl-2蛋白表达来实现的。endprint

综上所述， 丁苯酞具有一定的神经保护作用， 其治疗缺血性脑血管病的机制较为复杂， 具体作用机制仍不十分清楚， 可能通过上调Bcl-2蛋白的表达来实现， 使脑梗死体积缩小， 神经功能缺损程度减轻。本实验结果为临床治疗缺血性脑血管病提供了有力的理论基础， 但也存在不足之处， 例如丁苯酞治疗的具体作用靶点及途径仍无法证实， 将来还需要进一步探究。

参考文献

[1] Liao SJ， Lin JW， Pei Z， et al. Enhanced angiogenesis with dl -3n-butylphthalide treatment after focal cerebral ischemia in RHRSP. Brain Research， 2009， 1289（1289）：69.

[2] Longa EZ， Weinstein PR， Carlson S， et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke， 1989， 20（1）：84.

[3] 蔡玉芬， 馬金辉， 李艳彬. 丁苯酞治疗轻度认知功能障碍的临床疗效. 神经损伤与功能重建， 2015（6）：545-546.

[4] 李琦， 吕静， 杨妹琴， 等. 丁苯酞联合血栓通治疗缺血性脑卒中患者神经功能的效果. 中国生化药物杂志， 2014， 34（6）：107-109.

[5] 郑峥， 陈兴泳， 程琼， 等. 丁苯酞注射液治疗进展性脑卒中的疗效及安全性研究. 中国全科医学， 2016， 19（3）：322-326.

[6] 刘永亮， 王丽娜， 李建民， 等. 丁苯酞对局灶性脑梗死大鼠脑水肿及咬合蛋白表达的影响. 临床神经外科杂志， 2013， 10（3）： 156-158.

[7] Czabotar PE， Lessene G， Strasser A， et al. Control of apoptosis by the BCL-2 protein family： implications for physiology and therapy. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2014， 15（1）：49.

[8] Chen W， Xu B， Xiao A， et al. TRPM7 inhibitor carvacrol protects brain from neonatal hypoxic-ischemic injury. Molecular Brain， 2015， 8（1）：11.

[9] Volkmann N， Marassi FM， Newmeyer DD， et al. The rheostat in the membrane： BCL-2 family proteins and apoptosis. Cell Death & Differentiation， 2014， 21（2）：206-215.endprint