外周血淋巴细胞维生素D受体表达与冠心病的相关性研究

艾思迪，丁 茹，贺治青，吴宗贵，梁 春

·临床医学论著·

外周血淋巴细胞维生素D受体表达与冠心病的相关性研究

艾思迪，丁 茹，贺治青，吴宗贵，梁 春

目的观察冠心病病人外周血中淋巴细胞维生素D受体(VDR)表达的变化情况，并探讨其在冠心病病人诊治中的潜在价值。方法采用流式细胞术检测50例冠心病病人及30名健康对照志愿者外周血淋巴细胞VDR的表达水平(平均荧光强度VDR-MFI)，同时收集相关资料并检测血脂、空腹血糖、糖化血红蛋白、维生素D等指标。结果冠心病病人淋巴细胞的log10VDR-MFIs显著低于健康对照人群(P=0.028)，且与糖化血红蛋白呈负相关(r= -0.347，P=0.002)；多因素分析提示log10VDR-MFIs与冠心病独立相关(OR=0.051，P=0.019)。结论与健康人群相比，冠心病病人淋巴细胞表面VDR表达显著降低，且与糖化血红蛋白水平呈负相关，外周血淋巴细胞表面VDR表达降低可能是冠心病的潜在危险因素。

冠心病；外周血；淋巴细胞；维生素D受体

动脉粥样硬化是心脑血管疾病的病理基础，其发病机制尚未阐明，免疫应答在动脉粥样硬化的发展中起着重要作用[1]。近年研究发现维生素D对免疫系统有干预作用，通过作用于T淋巴细胞相关的免疫反应。维生素D生物活性形式1，25-二羟基维生素D3通过与特异性受体维生素D受体(VDR)结合而调节相关的基因表达，调节阶梯免疫系统功能，目前已知VDR广泛表达于T淋巴细胞、巨噬细胞、胸腺内未成熟的淋巴细胞及成熟的CD8淋巴细胞，但其功能和临床意义尚不清楚[2]。本研究旨在观察冠心病病人与健康对照人群外周血中淋巴细胞VDR表达的差异，初步探讨外周血淋巴细胞VDR表达在冠心病诊治中的潜在价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2016年4月—12月本院心内科首次住院病人80例，均行冠状动脉造影检查。根据冠状动脉造影是否正常分组，冠心病组左主干、左前降支、左旋支、右冠状动脉或其主要分支狭窄≥50%，共50例。健康对照组，冠状动脉造影正常或心肌桥，共30例。排除标准：心肌病、慢性心房纤颤、合并Ⅲ/Ⅳ级心功能不全(纽约心脏病学会分级)、过去6个月内经历过再血管化治疗；慢性肾功能不全[估算肾小球滤过率lt;90 mL/(min·1.73 m2)]、慢性肝病、肠道功能性和炎症性疾病、与维生素D相关的代谢性疾病、严重感染、肿瘤、嗜酒以及3个月内正在服用含维生素D制剂的药物。

1.2 一般资料采集、生化指标检查及SYNTAX评分 采集所有病人高血压病、糖尿病、吸烟等一般资料；于次日清晨空腹采集外周静脉血，检测三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹血糖、超敏C反应蛋白(hs-CRP)及25羟维生素D[25(OH)D]等；SYNTAX由两名高年资冠状动脉介入主任医生明确冠状动脉病变情况后，再由两名介入医师按SYNTAX评分要求将结果逐项输入SYNTAX评分器(2.1版本)，计算SYNTAX分值。SYNTAX评分lt;22分为低SYNTAX评分组，SYNTAX评分≥22分位高SYNTAX评分组[3]。

1.3 淋巴细胞表面VDR检测方法 取100 μL用肝素抗凝的全血，加入5 μL FcR阻断抗体，孵育10 min，按照说明书后加入小鼠抗人CD45抗体(FITC； Beckton Dickinson)及小鼠抗人 VDR 抗体(Abcam)，冰上孵育10 min。用生理盐水洗涤游离抗体后加入大鼠抗小鼠二抗(APC；Abcam)，孵育10 min，再经过红细胞裂解、洗涤、重悬后通过流式细胞检测淋巴细胞表面VDR平均荧光强度(VDR-MFIs)。以CD45和SS分别为坐标轴圈取淋巴细胞群[4]，检测APC阳性信号的平均荧光强度。由于VDR-MFI原始数值分布偏态，故采用log10对原始数值进行转化再进行后续统计分析。

2 结 果

2.1 流式细胞检测淋巴细胞VDR结果 流式细胞仪检测淋巴细胞VDR的结果图。图1a：应用CD45和SS建立直方图，根据CD45和SS指标特征，选择淋巴细胞群进行分析。图1b是对图1a所选取的淋巴细胞检测VDR受体，VDR+门内的细胞为VDR阳性细胞，如图1b所示，所有的淋巴细胞均为VDR阳性细胞。

图1流式细胞检测淋巴细胞VDR结果图

2.2 两组临床资料比较 冠心病组患糖尿病比例大于对照组(P=0.001)，糖化血红蛋白水平(Plt;0.001)及空腹血糖(P=0.004)也显著高于对照组。两组年龄、性别比例、吸烟比例及血脂水平无统计学意义。详见表1。冠心病组log10VDR-MFIs显著低于对照组(3.09±0.37 vs 3.26±0.30 P=0.028)，两组25(OH)D水平无统计学意义。冠心病病人中高SYNTAX评分亚组的高血压及糖尿病病人比例显著高于低SYNTAX评分组(Plt;0.05)，空腹血糖、LDL-C及HbA1c水平均高于低SYNTAX评分组，两组log10VDR-MFIs及25(OH)D水平无。详见表2、图2。

表1 两组病人临床资料比较

表2 冠心病各亚组病人临床资料

图2对照组与冠心病组log10VDR-MFIs及25(OH) D水平比较

2.3 相关性分析 各个临床参数与log10VDR-MFIs的相关性，可见log10VDR-MFIs和HbA1c成显著负相关(r=-0.347，P=0.002，见图3)。除了HbA1c之外，其他的临床参数如年龄、血脂、hs-CRP、25(OH)D、SYNTAX评分与log10VDR-MFIs无相关性。详见表3。

表3 淋巴细胞log10VDR-MFIs与临床指标之间的相关性分析

图3 Log10VDR-MFIs与HbA1c之间相关性分析

2.4 单因素及多因素Logistic回归分析 以有无冠心病为因变量，其他为自变量，进行Logistic回归分析，单因素分析提示糖尿病、高水平HbA1c及log10VDR-MFIs降低是冠心病的危险因素，多因素分析则提示log10VDR-MFIs降低是冠心病的独立危险因素(OR=0.051，P=0.019)。以SYNTAX积分高低为因变量，其他为自变量，进行Logistic回归分析，单因素分析提示高血压、糖尿病、空腹血糖升高、LDL-C升高及糖化血红蛋白升高为高SYNTAX评分的危险因素，多因素分析则提示高血压是高SYNTAX积分的独立危险因素。详见表4、表5。

表4 单因素及多因素logistic回归分析发现与冠心病发病相关的危险因素

表5 单因素及多因素logistic回归分析发现与高SYNTAX积分相关的危险因素

3 讨 论

冠心病是一种多危险因素激发的涉及慢性炎症、免疫功能紊乱的代谢性疾病，近年来大量研究提示淋巴细胞参与冠状动脉粥样硬化斑块形成和发展[5]。维生素D对免疫系统具有调节作用，其相应受体被报道广泛存在于外周淋巴细胞、巨噬细胞及胸腺组织中[6- 7]。维生素D能够抑制淋巴细胞释放炎性细胞因子，如TNF、IL-1、IFN-γ及IL-2，并增加释放抗炎细胞因子，如IL-4及IL-10，同时维生素D能够抑制B淋巴细胞IgE的表达[8]。与全身低密度脂蛋白受体(LDLR)基因单敲除小鼠相比，全身VDR及LDLR双敲除小鼠的主动脉处释放更多的黏附分子及促炎因子，而且巨噬细胞有更多的胆固醇流入，导致主动脉斑块形成加速[9]。沉默VDR后，T细胞的肾素-血管紧张素系统(RAS)激活并诱导T细胞凋亡，激活VDR不仅能够抑制T细胞的RAS并促进DNA修复[10]。因此，维生素D/VDR具有调节免疫系统的功能，并影响冠状动脉粥样硬化的病程进展。

在2型糖尿病病人中，颈动脉粥样硬化与血浆25(OH) D水平降低相关[11]；2型糖尿病合并糖尿病肾病、视网膜病变及神经病变等微血管并发症病人25(OH) D水平显著低于无微血管并发症的2型糖尿病病人[12]。但本研究并未能发现冠心病病人外周血25(OH) D水平低于对照组。事实上，25(OH) D经过肾脏由1α羟化酶转化形成的1，25(OH) D是维生素D的活性形式，但由于1，25(OH) D的血浆浓度过低，不易测量，而且易于失活，故临床上常用25(OH) D浓度反应体内维生素D水平[13-15]。因此低血浆浓度1，25(OH) D才是冠心病的高危因素，但目前无相关临床研究。最近的实验研究发现成纤维生长因子23(FGF23)能够抑制肾脏的1α羟化酶表达，进而影响血浆1，25(OH) D浓度[16]。因此，血浆FGF23浓度升高也有可能是冠心病的高危因素，但仍需进一步研究。

本研究提示淋巴细胞表面VDR表达量与糖化血红蛋白呈负相关，提示高糖状态可能降低淋巴细胞VDR表达。目前没有在体或离体实验研究高糖环境或晚期糖基化终产物(AGEs)对淋巴细胞的VDR表达影响的研究。腹腔注射链霉素诱导小鼠糖尿病模型发现糖尿病小鼠胰腺、肌肉及脂肪组织的VDR表达均显著降低，但这项研究没有讨论组织的VDR表达与血糖及糖化血红蛋白的相关性[17]，因此糖尿病环境与淋巴细胞VDR表达的相关性仍需要进一步研究[4]。

本研究表明冠心病病人淋巴细胞表明VDR表达显著低于对照组，淋巴细胞表面VDR表达量与糖化血红蛋白水平呈负相关，也是潜在的冠心病危险因素，但与冠状动脉病变严重程度无相关性，其具体联系机制及临床意义有待进一步研究证实。

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2017-07-12)

(本文编辑 王雅洁)

Correlation of Vitamin D Receptor Expression on Lymphocytes with Coronary Artery Disease

Ai Sidi，Ding Ru，He Zhiqing，Wu Zonggui，Liang Chun

Shanghai Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China

Liang Chun

ObjectiveTo uncover the differential expression of vitamin D receptor (VDR) on lymphocyte in patients with coronary artery disease (CAD) compared that in healthy controls and to discuss its potential significance in treatment of CAD patients.MethodsThe mean fluorescence intensities of VDR (VDR-MFIs) on peripheral lymphocytes were measured in 50 patients with CAD and 30 healthy controls without CAD.Clinical information of all subjects involved was collected and the levels of plasma lipids，fasting glucose，haemoglobin A1c (HbA1c)，and vitamin D were measured.ResultsThe log10VDR-MFIsof patients with CAD were significantly lower than those of healthy controls (P=0.028).The log10VDR-MFIswas negatively correlated with HbA1c(r=-0.347，P=0.002).Multivariate logistic regression analysis suggested log10VDR-MFIswere indepently associated with CAD (OR=0.051，P=0.019).ConclusionThe expression of VDR on peripheral lymphocytes in patients with CAD was significantly lower than that in healthy controls，which was negatively correlated with HbA1c.Lower VDR expression on peripheral blood lymphocytes might be a potential risk factor of CAD.

coronary artery disease； peripheral blood； lymphocyte； vitamin D receptor

R541.4 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.21.001

1672-1349(2017)21-2657-04

国家自然科学基金资助项目(No.8151101216、91539118、 81473445、81400336和81503371)，上海市科委中医引导性项目(No.15401931500)

上海长征医院(上海 200003)

梁春，E-mail：chunliangliang@hotmail.com

信息：艾思迪，丁茹，贺治青，等.外周血淋巴细胞维生素D受体表达与冠心病的相关性研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(21)：2657-2660.