肇庆地区血小板供者库的建立及应用

廖扬勋 陈志忠 余文潮 陈尚良 梁洁贞 陈超红 李结敏

肇庆地区血小板供者库的建立及应用

廖扬勋★陈志忠 余文潮 陈尚良 梁洁贞 陈超红 李结敏

目的 建立肇庆地区已知人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因分型及人类血小板抗原（human platelet alloantigen，HPA）HPA⁃1～6、9、15基因型的无偿机采血小板供者库，为临床血小板输注无效（platelet transfusion refractory，PTR）患者提供HLA及HPA相合的血小板。 方法 采用聚合酶链反应⁃序列特异性寡核苷酸探针（polymerase chain reaction⁃sequence specific olignuliotide probe，PCR⁃SSO）检测血小板供者的HLA基因分型及聚合酶链反应⁃序列特异性引物（polymerase chain reaction⁃sequence specific primer，PCR⁃SSP）检测 HPA⁃1～6、9、15基因型。对杂合度高的HPA⁃3、15随机抽样20个标本进行测序。对3例患者进行HLA⁃I分型。 结果 成功检测出101名无偿血小板捐献者HLA及HPA⁃1～6、9、15基因型；HPA⁃3、15的测序结果与PCR⁃SSP一致。HLA⁃A位点等位基因共检出11个；HLA⁃B位点共检出等位基因20个。3例患者中的1例从已知的HLA血小板库中找到完全一致供者，另外2例也找到三位点吻合的血小板供者。 结论 建立基于HLA⁃I类抗原及HPA基因分型的血小板供者资料库，有助于给PTR患者提供HLA和HPA相合的单采血小板。

HLA基因分型；HPA基因分型；血小板输注无效；血小板供者资料库；测序

目前临床上治疗血小板减少患者时，输注血小板是有效的措施，但反复输注有可能产生同种免疫，导致血小板输注无效。约有20%～50%白血病患者，80%的再生障碍性贫血患者长期输注血小板后输注无效［1］。引起血小板输注无效（platelet transfusion refractory，PTR）的原因众多，其中20%～30%为免疫因素［2］。由于血小板表面有丰富的人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）及人类血小板抗原（human platelet alloantigen，HPA），这些特异性抗原能通过输注血小板产生相应的抗体，将可能导致PTR。建立已知HPA及HLA基因供者资料库，能够为患者提供相配合的血小板，减少PTR的发生。随着分子生物学发展，HPA及HLA基因已阐明，本研究采用分子生物学PCR技术对血小板供者HPA及HLA进行基因分型，为患者提供相配合的血小板，具体报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究随机选择肇庆地区汉族机采血小板供者库中献血者101名，其中男性87人份，女性14人份，年龄19～55岁（平均年龄34.0岁），用于建立HLA及HPA基因定型的机采血小板供者库。选取了3例白血病患者（来源于肇庆市第一人民医院）进行应用研究。

1.2 主要试剂与仪器

Magcore DNA自动提取仪（RBC Bioscience Crop，中国台湾），HPA基因分型试剂盒（Innotrain，德国。批号：S9HX045），HLA基因分型试剂盒（北京曼泰里生物技术有限公司）；Taq酶（Promaga，美国），高速离心机（Eppendorf，德国），PCR扩增仪（ABI，美国），电泳仪（Bio⁃rad，美国），凝胶成像系统（杭州朗基科学仪器有限公司，型号：LG2020D）。

1.3 DNA制备

使用Magcore DNA自动提取仪提取及测定DNA浓度，具体操作步骤按说明书进行。DNA浓度测定范围为20～60 ng/μL，纯度测定A260/A280比率为1.6～2.0。DNA储存于-20℃备用。

1.4 聚合酶链反应⁃序列特异性引物（polymerase chain reaction⁃sequence specific primer，PCR⁃SSP）扩增

PCR⁃SSP扩增，具体操作步骤按试剂盒说明书进行，每人份用量：取Ready PCR Buffer工作液60 μL、Taq酶1.6 μL、DNA标本1000 ng，其余加水，总反应体积混合液为200 μL。用振荡器混合后，并瞬时离心，使液体置于管底，分别向PCR反应板每个引物孔各加入上述混合液10 μL。加封盖后，将反应板放入设置好循环参数的PCR仪内，扩增程序：94℃ 2 min；94℃ 20 s，70℃ 60 s，5个循环；94℃ 20 s，65℃ 60 s，72℃ 45 s，10个循环；94℃ 20 s，61℃ 50 s，72℃ 45 s，20个循环；72℃ 5 min，4℃保存。

1.5 电泳

电泳取扩增产物5 μL于2%琼脂糖凝胶中，100 V电泳25 min，在凝胶成像仪下观察，进行结果判断并拍摄成像，保存试验结果。

1.6 血小板的HLA检测

具体操作步骤按北京曼泰里生物技术有限公司的聚合酶链反应⁃序列特异性寡核苷酸探针（polymerase chain reaction⁃sequence specific olignu⁃liotide probe，PCR⁃SSO）试剂盒说明书进行操作。

1.7 3例患者进行HLA检测

使用北京曼泰里公司PCR⁃SSO试剂盒进行HLA分型。

1.8 抽样20个标本进行测序

对杂合度高的HPA⁃3、15随机抽样20个标本进行测序，引物见表1。

表1 HPA⁃3、15的PCR⁃SBT引物设计Table 1 Design of PCR⁃SBT primers for HPA ⁃3 and 15

1.9 统计学分析

HPA基因频率=阳性基因数/总基因数，HPA基因型频率=基因型数/总基因数。所有数据应用SPSS 18.0统计处理软件，按统计学数据处理原则，进行χ2检验及相关分析。HLA基因分析应用pypop 进行分析［4］。统计数据以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血小板供者库HPA⁃1～6、9、15基因多态性分布情况

本地区人群HPA⁃2、3、5、6、15 基因分型频率均符合 Hardy⁃Weinberg 遗传平衡定律；HPA⁃3、15系统中抗原频率接近，HPA⁃2、5、6中aa基因型为主，HPA⁃1、9未检出b基因，结果见表2。其中1例样品 HPA⁃1～6、9、15 等位基因分型结果见图1。

2.2 HPA⁃3、15基因测序分型

采用我们合成的引物对20份随机标本作HPA⁃3、15基因测序分型：与PCR⁃SSP的结果完全一致。HPA⁃3与HPA⁃15的基因多态性测序图分别见图2、图3。

2.3 血小板供者库HLA等位基因分型及特征

HLA⁃A位点共检出等位基因11个，见表3。

表2 肇庆地区HPA⁃1～6、9、15基因型和基因频率分布Table 2 Genotype and gene frequency distribution of HPA⁃1～6,9,15 in Zhaoqing

图1 1例标本的HPA⁃1～6、9、15等位基因分型结果电泳图Figure 1 One case of HPA⁃1～6,9,15 allelic pattern electrophoresis results

图2 HPA⁃3基因分型测序图Figure 2 HPA⁃3 genotyping sequence map

其中频率高于5%的等位基因是：A11、A02、A24、A33；HLA⁃B位点共检出等位基因20个，见表3。

图3 HPA⁃15基因分型测序图Figure 3 HPA⁃15 genotyping sequence map

表3 肇庆地区血小板献血人群HLA⁃A、B等位基因频率（%）Table 3 Allele frequencies of HLA⁃A and B alleles in platelet donors in Zhaoqing（%）

其中频率高于5%的等位基因是：B13、B46、B75、B60、B38、B58和B51。

2.4 血小板供者库HLA⁃A、B位点两座位单倍型频率和特征

HLA⁃A、B位点两座位单倍型结果，见表4。

2.5 患者的HLA的基因分型

3例患者的HLA基因分型结果如下，见表5。

表4 肇庆地区献血者频率高于0.5%的HLA⁃A、B单倍型（%）Table 4 Haplotype frequencies of HLA⁃A and B alleles in platelet donors in Zhaoqing（%）

表5 3例患者的HLA的基因分型Table 5 Genotyping of HLA in 3 patients

3 讨论

引起PTR的原因众多，其中20%～30%为免疫因素［2］。人类血小板表面具有复杂的血型抗原，与输血相关且抗原性较强的有2大类，其中之一是人类白细胞抗原（HLA），血小板表面有HLA⁃I类抗原，缺少 HLA⁃Ⅱ类抗原［4⁃5］。本研究中只针对血小板上的HLA⁃I类抗原即HLA⁃A与HLA⁃B等位基因进行分型。由于本研究采用PCR⁃SSO的方法，相对于PCR⁃SSP来说，具有分辨率高、特异高的特点，最重要的一点是可以进行大批量操作，PCR⁃SSP则不能达到相应的要求，因此利用PCR⁃SSO可以快速便捷把血小板供者HLA资料库建立起来。本研究中，HLA⁃A位点共检出11个不同等位基因，其中频率高于5%的等位基因是：A11、A02、A24、A33；HLA⁃B 位点共检出 20个不同等位基因，其中频率高于5%的等位基因是：B13、B46、B75、B60、B38、B58和B51。HLA⁃A频率大于30%的等位基因有A2及A11，HLA⁃B大于频率10%的有B13、B46及B75，此结果与文献报道南方人群的 HLA 基因分型大致相同［4⁃7］。

建立血小板供者HLA资料库，这对于HLA抗体引起的PTR，就可以从血小板库中更容易找到相配合的血小板供者。单倍型分析中发现频率大于10%的有A2⁃B46和 A11⁃B13，表明可选择HLA相合供者概率更大。本研究对3例患者的HLA基因分析中，1例从已知的HLA血小板库中找到完全一致供者，另外2例也找到三位点吻合的血小板供者。如果有患者需要，只要对患者进行HLA分型，就可以从血小板库里查找相合的供者，而且相合度越高输注效果越好［8］。

虽然引起PTR的主要为HLA抗体，但另一大类血小板抗原HPA引起的PTR也有相当比例。据文献报道，因 HPA 不合导致 PTR 大于 10%［9⁃10］，因此同时建立血小板供者HPA资料库，也尤为重要。HPA基因分型方法主要有：PCR⁃SSO、限制性片断长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、PCR⁃SSP 等。PCR⁃SSO 方法比较繁琐，判断试验结果不太容易，而且需要昂贵的仪器。RFLP方法较PCR⁃SSO方法简单，但由于需要限制性内切酶的使用及消化步骤，仍较为繁琐。PCR⁃SSP扩增后凝胶电泳，直接获得结果，比前2种方法较简单而且快速、经济。本研究应用PCR⁃SSP方法对血小板基因进行分型，检测了肇庆地区101名随机固定血小板献血者的HPA⁃1～6、9、15基因分布，其中HPA⁃2、3、5、6、15基因分型频率均符合Hardy⁃Weinberg遗传平衡定律。发现HPA⁃3、15出现高度多态性，HPA⁃2、5、6的基因型以aa为主。HPA⁃1、9未检出b基因，均为a/a纯合子。血小板抗原HPA不合的血小板输注中，欧州各国血小板输注无效多数是由于HPA⁃1a基因引起的。亚洲地区人群约99%具有HPA⁃1a基因［12⁃16］，与肇庆地区基本一致。本研究加入了多态性不高的HPA⁃9基因分型，虽然未检出b基因，均为a/a纯合子，但提示肇庆地区HPA⁃9b基因的确基本接近无，与山东地区、广西地区一致［12，14，16］。HPA⁃3、15为高多态性表达基因，我们的检测结果表明HPA⁃3、15基因多态性中的不配合率较高，在输血上具有重要的免疫学意义。同时笔者对HPA⁃3、15进行基因分析测序，结果与PCR⁃SSP一致。HPA基因PCR⁃SBT分型技术具有高分辨率，图2及图3中显示可以从2方面来分辨：第一，从颜色来区分，HPA⁃3a与HPA⁃3b为多态性位置峰分别为红色与黑色单峰，HPA⁃15a与HPA⁃15b为多态性位置峰分别为蓝色与绿色单峰；第二，从峰的多少来分辨，出现双峰的都是杂合基因型分别是 HPA⁃3ab及 HPA⁃15ab。PCR⁃SBT 分型技术具有高精确度、从峰图能直接发现是否存在新的等位基因等特点，而且可以弥补PCR⁃SSP的不足之处，是一种具有广泛应用前景的检测技术。

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Establishment and clinical application of platelet donor registry in Zhaoqing area

LIAO Yangxun★,CHEN Zhizhong,YU Wenchao,CHEN Shangliang,LIANG Jiezhen,CHEN Chaohong,LI Jiemin
（Zhaoqing Blood Center,Zhaoqing,Guangdong,China,526040）

Objective To establish a human leukocyte antigen(HLA)and human platelet alloantigen(HPA)⁃1～6,9,15 genetic and volunteer apheresis platelet donor registry in Zhaoqinq;to provide matched HLA and HPA platelets for patients with platelet transfusion refractoriness(PTR). Methods The polymerase chain reaction⁃sequence specific primer(PCR⁃SSP)method was established for HPA⁃1～6,9,15 genotyping.HLA genotyping was performed by polymerase chain reaction⁃sequence specific olignuliotide probe(PCR⁃SSO).The HPA ⁃3,15 genotype of a random 20 specimens were analyzed by sequence⁃based typing(SBT)method.Results The PCR⁃SSP method for HPA⁃1～6,9,15 genotyping was established and the HLA typing of 101 donors were identified.HPA⁃3,15 sequencing results are consistent with the PCR⁃SSP.HLA⁃A locus were detected 11 alleles,while 20 allele genes were detected at HLA⁃B locus. Conclusion A platelet donor database based on HLA⁃I class antigen and HPA genotyping was established.It is helpful to provide HLA and HPA compatible apheresis platelets for PTR patients.

HLA genotyping;HPA genotyping;Platelet transfusion refractory;Platelet donor registry;Sequencing

广东省肇庆市科技计划项目（2014F006）

肇庆市中心血站，广东，肇庆526040

★通讯作者：廖扬勋，E⁃mail：13929881671@163.com