上皮性卵巢癌血浆中microRNA⁃30a⁃5p含量与分级及分期的关系

徐文莉 林燕华 罗艺 李康 张洪德

上皮性卵巢癌血浆中microRNA⁃30a⁃5p含量与分级及分期的关系

徐文莉 林燕华 罗艺 李康 张洪德★

目的 研究上皮性卵巢癌患者血浆中microRNA⁃30a⁃5p与卵巢癌分级、分期的关系，探讨其在卵巢癌中的诊断价值。 方法 选取111例上皮性卵巢癌患者，患者病理分级为低级上皮性卵巢癌52例，高级上皮性卵巢癌59例，根据国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期标准：Ⅰ期24例，Ⅱ期27例，Ⅲ期32例，Ⅳ期28例；同期健康女性体检者20例，采用实时荧光定量PCR检测血浆中microRNA⁃30a⁃5p的表达，分析microRNA⁃30a⁃5p表达与上皮性卵巢癌分级及分期的关系。 结果 与正常对照组比较，上皮性卵巢癌患者血浆中microRNA⁃30a⁃5p明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），高级上皮性卵巢癌患者血浆中microRNA⁃30a⁃5p表达量明显低于低级（P＜0.05）；随着肿瘤分期恶性度的升高，microRNA⁃30a⁃5p相对表达量下降，但Ⅰ期与Ⅱ期结果差异无统计学意义（P＞0.05），其余各组差异均有统计学意义（P＜0.05）。 结论 microRNA⁃30a⁃5p的表达与上皮性卵巢癌发生、发展以及肿瘤的恶性度有关，为肿瘤的靶向治疗提供了依据。

上皮性卵巢癌；microRNA；血浆；实时荧光定量PCR

上皮性卵巢癌在女性肿瘤中致死率极高，在过去的几十年，卵巢癌患者生存率有了明显升高。卵巢癌早期诊断5年生存率可达90%，但是大部分患者确诊时已是肿瘤晚期，长期生存率低于30%［1］。临床上常用血清标志物CA125作为对疾病的诊断，但是其灵敏度仅为40%［2］。从而使得发现一种敏感性及特异性的标志物显得尤为重要。MicroRNA（miRNA）是一类长18～24个核苷酸的非编码小分子单链RNA。miRNA通过完全或部分碱基配对与靶分子 3′⁃非翻译区（3′⁃untranslated region，3′⁃UTR）结合，降解或抑制 mRNA 的翻译，从而抑制靶基因的表达。研究表明miRNA参与生长、发育、细胞增殖、细胞分化细胞周期及凋亡等重要过程［3］。miRNA在肿瘤形成方面主要通过干扰细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移基因的表达发挥关键作用，如引发肿瘤生长、肿瘤发展、分化等。研究显示miRNA在肿瘤的发生发展过程中呈不同程度的表达［4］，扮演着致癌与抑癌不同的角色。研究证实miRNA不仅在肿瘤组织内稳定表达，而且能稳定存在于血清、血浆、全血中［5］，从而表明循环miRNA可作为一种无创的肿瘤诊断标志物。Shapira等［5］研究发现卵巢癌患者血浆和全血microRNA⁃30a⁃5p的表达量明显下降。但是目前的研究仅仅局限于卵巢癌患者与正常健康者间的表达差异，研究不同分级、分期上皮性卵巢癌microRNA⁃30a⁃5p表达差异的报道不多。本研究通过检测上皮性卵巢癌血浆中microRNA⁃30a⁃5p的水平，分析其与上皮性卵巢癌分级、分期的关系，为临床医生更好地诊治上皮性卵巢癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2014年6月到2016年11月在我院住院病理检查证实为上皮性卵巢癌患者111例，年龄38～71岁，平均（52.5±3.5）岁。所有患者术前均未接受化疗、放疗及免疫治疗。病理分级为低级上皮性卵巢癌52例，高级上皮性卵巢癌59例；根据国际妇产科联盟（International Federation of Gyne⁃cology and Obstetrics，FIGO）分期标准［6］：Ⅰ期 24例，Ⅱ期27例，Ⅲ期32例，Ⅳ期28例。另取同期健康女性体检者20例作为对照，年龄36～69岁，平均（50.5±4.5）岁，两组人群年龄差异无统计学意义。

1.2 试剂与仪器

Roche总RNA提取试剂盒购于上海浩然生物技术有限公司，反转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒购于宝生物工程（大连）有限公司。microRNA⁃30a⁃5p与内参U6上下游引物由广州锐博生物有限公司完成。主要仪器：美国ABI7500实时荧光定量PCR仪，德国Sigina 3K30高速冷冻离心机，美国热电Multiskan go酶标分析仪，日本三洋MDF⁃382E超低温冰箱。

1.3 方法

1.2.1 标本采集

静脉采血3 mL，EDTA抗凝，4000 r/min离心15 min，取血浆放入干净Eppendorf管中，在10℃13000 r/min离心5 min，去除细胞碎片，处理好的血浆于-80℃冰箱中保存，以备RNA提取，该步骤在2 h内完成。

1.2.2 血浆总RNA提取

冻存的血浆标本复温，按照罗氏RNA提取试剂说明书提取血浆总RNA。Multiskan go酶标分析仪检测RNA纯度及浓度，OD260与OD280比值在1.8～2.0满足要求。

1.2.3 逆转录反应

应用TaKaRa反转录试剂盒中的特异性反转录引物并按照说明书逐步合成cDNA，反转录体系20 μL，反转录条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存反转录产物。

1.2.4 real⁃time PCR 反应

实时荧光定量PCR反应体系为20 μL，具体包括 ：SYBR Premix Ex Tap 10 μL，PCR Forward Primer 0.8 μL，PCR Reverse Primer 0.8 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，RT 反应液2 μL，dH2O 6 μL，反应条件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 个循环。所有样本做3个复孔。以U6为内参照，采用相对定量法计算microRNA⁃30a⁃5p的相对表达量，以 2⁃ΔCt表示，ΔCt=CtmicroRNA⁃30a⁃5p⁃CtU6，Ct为每个反应管中的荧光信号达到所设定阈值时所经历的循环数。

1.3 统计学处理

运用SPSS 19.0软件对数据进行分析，计量数据采用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 上皮性卵巢癌患者血浆中microRNA⁃30a⁃5p表达量下调

经实时荧光定量PCR检测，结果显示上皮性卵巢癌患者血浆中microRNA⁃30a⁃5p明显下降，为2.42±1.43，对照组为6.33±2.01，通过t检验，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结果显示，详见图1。

图1 microRNA⁃30a⁃5p在上皮性卵巢癌患者及对照组中的表达Figure 1 Expression of microRNA⁃30a⁃5p in epithelial ovarian cancer patients and control group

2.2 不同分级上皮性卵巢癌患者血浆中microR⁃NA⁃30a⁃5p 表达量的比较

低级上皮性卵巢癌患者血浆中microRNA⁃30a⁃5p表达量为3.13±0.04，高级上皮性卵巢癌患者血浆中microRNA⁃30a⁃5p表达量为1.67±1.41，二者结果差异具有统计意义（P＜0.05）。结果显示，详见图2。

2.3 上皮性卵巢癌患者血浆中microRNA⁃30a⁃5p与肿瘤分期的关系

不同分期microRNA⁃30a⁃5p值分别为TⅠ：3.98±0.36，TⅡ：3.78±0.97，TⅢ：1.88±0.21，TⅣ：0.15±0.13；随着肿瘤分期恶性度的增加microRNA⁃30a⁃5p表达逐渐降低，各期患者血浆中microRNA⁃30a⁃5p间比较采用方差分析，TⅠ与TⅡ期上皮性卵巢癌患者血浆中microRNA⁃30a⁃5p表达量没有统计学差异（P=0.804），TⅠ与TⅢ期间、TⅠ与TⅣ期间、TⅡ与TⅢ期间、TⅡ与TⅣ期间、TⅢ与TⅣ期间上皮性卵巢癌患者血浆中microRNA⁃30a⁃5p表达量均有统计学差异（P值分别为0.031、0.019、0.038、0.023、0.045）。结果显示，详见图3。

图2 上皮性卵巢癌患者血浆中microRNA⁃30a⁃5p在不同分级的表达Figure 2 Expression of microRNA⁃30a⁃5p in different grading of ovarian cancer patients

图3 上皮性卵巢癌患者血浆中microRNA⁃30a⁃5p在不同肿瘤分期的表达Figure 3 Expression of microRNA⁃30a⁃5p in different staging of ovarian cancer patients

3 讨论

在全球，卵巢癌是女性死亡的第五大原因［1］，大部分原因在于缺乏对卵巢癌早期诊断有效的检测手段。目前生存率低的一个重要因素是人们对该疾病的发生及发展机制尚不完全清楚，因此探索肿瘤的发病机制，寻找对肿瘤诊断敏感性及特异性高的标志物显得尤为重要。随着近年miRNA在癌症中的研究，有助于对癌症发生发展的进一步理解，为癌症的早期诊断提供新的思路。目前超过1000多种miRNAs在人类基因中被发现。研究发现miRNA在癌症的发生发展、血管再生及免疫反应方面扮演着重要的角色［7］。2008年Law⁃rie首次测定血清中miRNA的表达后，越来越多科研者注重循环中miRNA在肿瘤中的诊断价值。miRNA作为新兴标志物受到重视，microRNA⁃30作为miRNA的一个成员，其也参与多种生物学功能的控制，如上皮间质转化、成骨细胞分化、肿瘤的发生发展等［8⁃9］。microRNA⁃30位于人类第1、6和8号染色体上，包括 microRNA⁃30a、microRNA⁃30b、microRNA⁃30c、microRNA⁃30d、microRNA⁃30e等主要成员。microRNA⁃30a⁃5p是由 microRNA⁃30a 5′端臂加工修饰而来，在多种恶性肿瘤中表达下降，扮演肿瘤抑制因子的作用，如microRNA⁃30a⁃5p在肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌及上皮性卵巢癌等肿瘤中表达明显下降［10⁃13］。Taylor及Resnike等［14］研究证实卵巢癌患者外周血与癌组织中miRNA的表达未见明显差异，以及外周血miRNA具有良好的稳定性，从而提示血液中肿瘤来源的miRNA可以便捷、可靠地提供卵巢癌病灶中miRNA的实际水平。所有上述研究结果表明外周血microRNA⁃30a⁃5p的出现为上皮性卵巢癌的无创诊断提供了希望。本研究结果显示上皮性卵巢癌患者血浆microRNA⁃30a⁃5p较正常对照组明显降低，这与文献报道一致［5］，但是目前的研究仅仅局限于卵巢癌患者与正常健康者间的表达差异，未对肿瘤分级与分期中的表达进行研究，本研究进一步深入研究，对上皮性卵巢癌进行精确地分级及分期，具体到肿瘤病理分级以及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期，观察microRNA⁃30a⁃5p是否与肿瘤病变程度有关。本研究结果表明，不同分级、分期上皮性卵巢癌血浆之间microRNA⁃30a⁃5p表达有差异，随着肿瘤恶性度的升高，microRNA⁃30a⁃5p表达逐渐降低，尤其在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期间的降低幅度尤为明显。因此血浆中microRNA⁃30a⁃5p的水平可作为上皮性卵巢癌患者的预后评价指标。

研究证明miRNA通过与靶基因的结合共同发挥作用，实现对肿瘤发生发展的调控，文献报道microRNA⁃30a⁃5p以MTDH/PTEN/AKT及AEG⁃1、PIK3D、Wnt/β⁃Catenin/BCL9等为作用靶点，调节癌细胞的生长及凋亡、侵袭与转移及耐药［13，15］。但是miRNA与靶基因间的连接也不是一对一的，一个miRNA可以与上百种靶基因结合发挥作用，一个mRNA可以被其它多种miRNAs调节。但本研究只是描述不同分期与分级上皮性卵巢癌血浆中microRNA⁃30a⁃5p的表达差异，没有涉及microRNA⁃30a⁃5p作用靶点，因此，microRNA⁃30a⁃5p在上皮性卵巢癌中具体的分子作用机制还有待于进一步研究。

综上所述，血浆microRNA⁃30a⁃5p表达水平与上皮性卵巢癌分级、分期有关，可能是上皮性卵巢癌分期发生发展的重要因素，可作为一个重要的无创检测指标。但是miRNA的作用是众多miRNA分子及靶基因共同调控完成的。因此，应同时分析与其它上皮性卵巢癌特异性标志物以及靶基因之间的相互关系，以便进一步深入了解上皮性卵巢癌的发生机制，为疾病的诊治提供理论依据和治疗靶点，从而进一步提高病人的生存率。

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Relationship between plasma microRNA⁃30a⁃5p content and grading and staging in epithelial ovarian cancer

XU Wenli，LIN Yanhua，LUO Yi，LI Kang，ZHANG Hongde★
（Central Laboratory of Longgang Center Hospital，Shenzhen，Guangdong，China，518116）

Objective To investigate the relationship between plasma microRNA⁃30a⁃5p level and grading and staging of ovarian cancer,and to explore the diagnostic significance for epithelial ovarian cancer.Methods A total of 111 cases of patients with epithelial ovarian cancer were recruited,52 cases of patients with pathological grading for low⁃grade epithelial ovarian cancer,59 case for advanced epithelial ovarian cancer.The patients were divided into 4 groups:stageⅠ(24 cases),Ⅱ(27cases),Ⅲ (32 cases)andⅣ(28 cases),according to the International Federation of Gynecology and Obstetrics(FIGO).20 healthy female subjects were served as controls.The expression of microRNA⁃30a⁃5p in plasma was detected by quantitative real⁃time PCR,and the relationship between the expression of microRNA⁃30a⁃5p and the grading and staging of epithelial ovarian cancer was analyzed. Results Compared with the normal control group,microRNA⁃30a⁃5p in the plasma of patients with epithelial ovarian cancer was significantly decreased(P＜0.05).The expression of microRNA⁃30a⁃5p in patients with advanced epithelial ovarian cancer was significantly lower than that in low ⁃grade ovarian cancer(P＜0.05).With the malignant degree of tumor staging increased,the relative expression of microRNA⁃30a⁃5p decreased among the other groups(P＜0.05),except stageⅠandⅡ (P＞0.05).Conclusion The expression of microRNA⁃30a⁃5p is related to the occurrence,development and malignant degree of epithelial ovarian cancer,which may served as a novel diagnostic marker,and be used as a therapeutic target for the treatment of epithelial ovarian cancer.

Epithelial ovarian cancer;MicroRNA;Plasma;Quantitative real⁃time PCR

深圳市龙岗中心医院中心实验室，广东，深圳518116

★通讯作者：张洪德，E⁃mail：labzhd@126.com