HCV RNA水平与HCV基因型别的相关性研究

周萍 杨柳 李金洁 王晓琴

HCV RNA水平与HCV基因型别的相关性研究

周萍1★杨柳2李金洁2王晓琴1

目的 探讨丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）载量水平与HCV基因型别的相关性。方法 选取255例丙型肝炎患者，采用实时荧光定量逆转录PCR（reverse transcription quantitative real time PCR，RT⁃qPCR）检测HCV病毒载量水平，采用PCR⁃反向点杂交法（polymerase chain reaction⁃reverse dot blot，PCR⁃RDB）进行HCV基因分型检测。 结果 255例样本中，PCR⁃RDB法成功分型的246例（96.47%），未明确分型的9例（3.53%）；其中，1b型121例（47.45%），2a型107例（41.96%），3a型16例（6.27%），3b型6例（2.35%），6a型5例（1.96%）；5种HCV基因亚型中3b型和6a型病毒载量较高，显著高于其他3个亚型（P＜0.05）。 结论 采用PCR⁃RDB法进行HCV基因分型时需参考样本定量结果，低病毒载量会影响基因分型成功率；HCV RNA水平与HCV基因型别可能具有相关性。

丙型肝炎病毒；PCR⁃反向点杂交法；基因型；病毒载量

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染严重危害人类的健康。全世界约有1.7亿人受到HCV的感染［1］，我国更是一个HCV感染大国。丙型肝炎病毒感染可导致肝脏发生炎症坏死和纤维化，部分丙型肝炎患者可以发展为肝硬化甚至肝癌，给社会和家庭带来沉重负担［2］。HCV基因型分布具有明显的地域差异性和人群差异性，不同基因型病毒生物学特性不同，对药物的反应敏感性也不同。因此，HCV基因分型对丙型肝炎患者的诊断和治疗至关重要。丙型肝炎病毒基因分型方法很多，直接测序法是“金标准”，但操作费时费力，检测周期长、成本高，对医院人力、物力和财力要求严格，并不利于临床广泛使用。PCR与反向斑点杂交技术相结合的方法，在以往的HCV基因分型检测中表现出较好的特异性和准确性［3］，且操作简便、高效、经济，中小型医院即可实现检测，利于丙肝分型检测的普及。但其分型结果往往受到HCV RNA水平的限制，本研究基于PCR⁃反向点杂交法（polymerase chain reaction⁃reverse dot blot，PCR⁃RDB）探讨了HCV RNA水平对HCV基因分型效果的影响，并分析了HCV基因型别与HCV核酸水平的相关性，为丙型病毒性肝炎的治疗及其疫苗研制提供科学依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2015年1月至2016年12月间来自西安交通大学第一附属医院和西京医院住院及门诊就诊的丙型肝炎病毒感染患者255份标本，其中男性105份，女性150份，年龄16～83岁，平均年龄（48.21±13.65）岁。患者诊断均符合中华医学会肝病学分会和感染病学分会联合发布的中国《丙型肝炎防治指南（2015年更新版）》中的诊断标准［4］。

1.2 试剂及仪器

丙型肝炎病毒实时荧光定量试剂盒（RT⁃qP⁃CR法）和丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒（PCR⁃RDB），由中山大学达安基因股份有限公司生产。仪器包括美国ABI 7500型荧光定量PCR仪，德国Hermle Z216 MK微量高速冷冻型离心机，杭州奥盛仪器有限公司生产的干式恒温器，常州菲普实验仪器厂生产的电热恒温振荡水槽。1.3 HCV RNA定量与HCV基因分型

1.3.1 血浆HCV总RNA提取

用EDTA抗凝采血管抽取受检者静脉血4 mL，1500 r/min离心2 min，吸取上层血浆200 μL用于RNA的制备。取灭菌的1.5 mL离心管，加入 50 μL 蛋白酶 K，取 200 μL 血浆，再加入200 μL病毒裂解液（已含Carrier RNA，主要成分为 Triton X⁃100），振荡混匀，高速离心 10 s，72℃放置 10 min，最后加洗脱液 50 μL（72℃预热），备用。

1.3.2 HCV RNA定量扩增

参照中山大学达安基因股份有限公司生产的丙型肝炎病毒实时荧光定量试剂盒（RT⁃qPCR法）说明书操作要求和ISO15189实验室操作程序进行反应体系的操作，体系完成后在ABI 7500型实时荧光定量PCR仪上检测标本中的HCV RNA载量。

1.3.3 反转录 PCR（reverse transcription PCR，RT⁃PCR）分型扩增

按照中山大学达安基因股份有限公司丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒（PCR⁃RDB）的说明书进行 RT⁃PCR 扩增。扩增总体系 50 μL：酶系、引物、PCR buffer混合液20 μL，1.3.1中RNA 提取液30 μL（待测标本及阴、阳性质控品），两者混合后瞬时离心，将反应管放入PCR仪，按下列条件扩增：50℃逆转录 25 min；95℃预变性 15 min；94℃30 s、55℃ 40 s、72℃ 45 s，共 45 次循环；72℃延伸7 min。PCR产物可直接进行杂交反应，或置于4℃短期保存，或置于⁃20℃长期冻存。

1.3.4 杂交反应及结果判读

严格按照中山大学达安基因股份有限公司生产的丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒中杂交反应说明书进行。其步骤包括预杂交、杂交、洗膜、显色、结果判读。HCV基因分型杂交膜条上共12个位点，其中位点G1～G10为各型别检测探针，PC为扩增控制点，CC为显色控制点，位点排列如图1所示。根据说明书要求，可将CC点、PC点和各型别位点cut off值预设在分析软件中，分析结束后由软件自动生成各位点信号值、阴阳性和相应的HCV型别；也可参照结果分析表肉眼进行结果判读，HCV基因型常见结果分析表见表1。患者HCV型别均由肉眼判读所得。

图1 HCV基因分型杂交膜条位点排列Figure 1 Sequencing of hybridization membrane strip sites of HCV genotyping

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS 16.0进行统计学分析，计量资料应用方差分析，计数资料用χ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

表1 HCV基因分型常见结果分析表Table 1 Analysis of major HCV genotypes

2 结果

2.1 HCV RNA定量检测

对255例所选患者标本进行HCV RNA定量检测，病毒载量为103～108IU/mL。其中103IU/mL 15例，104IU/mL 67例，105IU/mL 82例，106IU/mL 66例，107IU/mL 24例，＞108IU/mL 1例，定量结果满足HCV基因分型要求。

2.2 HCV基因分型结果

255例样本中，PCR⁃RDB法成功分型246例，分型率为96.47%（246/255），9例不能明确分型的样本经直接测序法明确分型结果。HCV基因分型结果为：1b型121份，占47.45%；2a型107份，占41.96%；3a型 16份，占 6.27%；3b型 6份，占2.35%；6a型5份，占1.96%。

2.3 HCV核酸水平与PCR⁃RDB法HCV基因分型成功率的相关性

将255例样本按不同病毒载量水平进行分组，观察不同病毒载量时PCR⁃RDB法HCV基因分型成功率，结果见表2。9例未成功分型的样本包括：103IU/mL 2例，分别为1b型和6a型；104IU/mL 2例，均为3a型；105IU/mL 2例，均为2a型；106IU/mL 1例，均为 2a型；107IU/mL 2例，分别为2a型和6a型。核酸水平在103IU/mL（PCR⁃RDB法基因分型载量要求临界值）时分型成功率最低，差异具有统计学意义。

2.4 HCV RNA核酸水平与HCV基因型别相关性

对5种基因亚型的患者病毒载量水平进行统计与分析，如表3所示。结果显示，HCV 1b型的平均病毒载量最低，为（5.42±0.97）log IU/mL，3b型的平均病毒载量最高，为（5.76±0.73）log IU/mL。对5组亚型病毒载量进行单因素方差分析（one⁃way ANOVA），发现5种基因亚型之间病毒载量存在显著差异（F=2.793，P＜0.05）。再采用Tukey⁃test法进行两两比较（表4），发现3b型和6a型患者病毒载量显著高于其他3个亚型。

3 讨论

HCV是一种单股线性正链RNA黄病毒，最初于1975年在一名输血后的患者血清中被发现［5］。1989年Michael等首次克隆其基因组，并命名本病及其病毒分别为丙型肝炎和丙型肝炎病毒［6］。HCV感染是一个世界性的健康问题，其致病性强，且较易转为慢性，导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，并可发展为肝硬化和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。

表2 HCV核酸水平与PCR⁃RDB法分型成功率Table 2 The success ratios of HCV genotyping by PCR⁃RDB among different viral loads

表3 HCV不同基因型患者平均病毒载量（x±s）Table 3 Patients'average viral loads among different genotypes of HCV（x±s）

表4 HCV不同基因亚型患者平均病毒载量的两两比较Table 4 Pairwise comparison of the viral loads between different genotypes of HCV

HCV基因型具有高度异质性。根据Sim⁃monds［7］建议，利用核酸测序和进化树分析结果，将HCV分为6种主要的基因型（用数字1～6表示）和100多个基因亚型（用小写英文字母表示）。HCV基因型分布具有明显地域差异，我国常见的丙肝病毒基因型为1b和2a，6a型主要见于香港和澳门地区［8］。本研究的患者多来自中国北方地区，结果表明仍以1b型和2a型为主，其他型别所占比例很少，这与以往的报道基本一致［9］。以往报道显示，不同基因型别的临床表现和治疗效果也不同［10⁃11］，深入 HCV 基因分型的研究，对丙型肝炎严重程度的评估以及抗病毒药物敏感性的预测具有重要意义［12］。1型HCV感染无论在干扰素治疗或口服抗病毒药物治疗中均较难获得病毒学持续应答（sustained virologic response，SVR），且预后效果较其他型别欠佳［13⁃14］。蒋玲丽等人［12］研究发现，患者体内抗HCV水平和HCV的基因型别有关，1b、2a、6a型患者抗体浓度分布均匀，1a型患者的抗体浓度相对较高，3b型的患者的抗HCV水平相对较低。由此猜想可能机体对3b型HCV的中和作用较弱，其病毒核酸水平较高。本文研究发现，HCV基因型别和病毒核酸水平具有相关性，且3b型的患者的病毒核酸水平明显高于1b型、2a型及3a型患者病毒核酸水平，这与蒋玲丽等人［12］的发现具有一致性。不同病毒基因型在患者体内的核酸水平具有差异，是不同丙肝病毒基因型别在患者体内的抗体应答机制有差异的另一个体现［15］，抗体中和能力强，其对应型别的病毒增殖受到抑制，因此其核酸水平则较低；排除中和抗体的影响，不同型别的病毒本身的增殖是否有差异还需要进一步研究和探索。由于本研究中部分型别标本量较少，相关性需要更大标本量的研究证实。

目前用于HCV基因分型的方法较多，包括全基因组直接测序分析法、序列特异性引物扩增法（polymerase chain reaction⁃sequence specific prim⁃ers，PCR⁃SSP）、限制性片段长度多态性分析法（re⁃striction fragment length polymorphism，RELP）、序列特异性核酸探针杂交法（PCR sequence specific oligonueleotide，PCR⁃SSO）、PCR⁃反向点杂交法等。全基因组直接测序分析法，是目前HCV基因分型方法中最经典、最准确的方法，分型结果最为可靠，是HCV基因分型的“金标准”。但此法耗时、费力且昂贵，并不适合所有的实验室使用［16］。PCR⁃SSP 法是较早普遍使用的方法，由于每份样品需同时进行多次检测才能最终确定基因型，因此操作繁琐检测周期长，使其临床应用受到限制［17］。RELP法是经PCR扩增靶基因后，用多种特定的限制性内切酶对PCR产物进行酶切，不同的基因型或亚型就可以得到长度大小不同的酶切片段，根据酶切后电泳所表现的片段大小及多态性进行HCV基因分型，该方法具有快速、经济等优点，但仅用少数几个内切酶，检测基因型别有限［18］。PCR⁃SSO法是利用RT⁃PCR扩增HCV基因片段，将扩增产物与膜上特异性探针杂交，经显色反应后实现HCV基因分型。该方法操作比较简便，但价格昂贵，不宜在实验室广泛推广应用［19］。PCR⁃RDB法，是通过将生物素或荧光素标记型特异性探针固相化在尼龙膜上，再与RT⁃PCR扩增的病毒产物进行杂交后，最终经肉眼判读出HCV基因型的分型方法。该方法特异性和准确性高，且不需要昂贵复杂的仪器设备，易于在临床广泛开展［3，20］。但 PCR⁃RDB 法对 HCV 核酸水平要求较高，尤其在PCR⁃RDB法基因分型载量要求临界值时，分型效果和结果均受到影响。本文对255份HCV⁃RNA检测阳性的患者进行HCV基因分型，PCR⁃RDB法的分型成功率为96.47%，对9份PCR⁃RDB法未能明确分型的标本，采用直接测序分析法检测均分型成功，表明测序法为HCV基因分型金标准。因此，临床上对PCR⁃RDB法分型效果较差或者不能成功分型的样本，建议进行测序法验证，以确保结果的准确性和可靠性。

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Study on the correlation between HCV RNA level and HCV genotypes

ZHOU Ping1★，YANG Liu2，LI Jinjie2，WANG Xiaoqin1
（1.Department of Clinical Laboratory，the First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an，Shanxi，China，710061；2.Department of Clinical Laboratory，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an，Shanxi，China，710032）

Objective To investigate the correlation between the HCV⁃RNA load and viral genotype. Methods 255 serum samples of chronic hepatitis C patients were collected.HCV RNA load were detected by RT⁃qPCR；HCV genotypes were detected with PCR⁃RDB. Results Of all 255 cases，96.47%（246/255）was typed successfully by PCR⁃RDB，but 3.53%（9/255）was not.121 cases（47.45%）were genotype 1b，107 cases（41.96%）were genotype 2a，16 cases（6.27%）were genotype 3a，6 cases（2.35%）were genotype 3b，5 cases（1.96%）were genotype 6a.Interestingly,the genotypes of HCV 3b and 6a had higher HCV⁃RNA load，compared to other genotypes(P＜0.05).Conclusion When the PCR ⁃RDB method was used for HCV genotyping,the quantitative results of the reference sample are required.The low viral load can affect the success rate of genetyping,suggesting the level of HCV RNA may be correlated with HCV genotypes.

Hepatitis C virus；PCR⁃RDB；Genotypes；Virus load

1.西安交通大学第一附属医院检验科，陕西，西安7100612.空军军医大学西京医院检验科，陕西，西安710032

★通讯作者：周萍，E⁃mail：Zhouping_xa@163.com