系统性红斑狼疮患儿外周血IL⁃6、IL⁃10、IL⁃17水平变化及其在单个核细胞中的表达研究

沈茹 李艳君 林丽佳

•论 著•

系统性红斑狼疮患儿外周血IL⁃6、IL⁃10、IL⁃17水平变化及其在单个核细胞中的表达研究

沈茹1★李艳君2林丽佳3

目的 研究系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）患儿外周血中白介素⁃6（interleukin⁃6，IL⁃6）、白介素⁃10（IL⁃10）、白介素⁃17（IL⁃17）水平的变化情况及其在外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中的表达情况。方法 选取46例SLE患儿及20例健康儿童分别为病例组（SLE组）和对照组（Control组），采用酶联免疫吸附测定法（enzyme⁃linked immunosorbent assay，ELISA）检测外周血中 IL⁃6、IL⁃10、IL⁃17 蛋白水平，采用实时荧光定量 PCR（quantitative real time polymerse chain reaction，qPCR）技术检测PBMCs中IL⁃6、IL⁃10、IL⁃17的 mRNA 表达水平，分析比较2组的蛋白和mRNA表达量的差异。 结果 SLE组IL⁃6、IL⁃10、IL⁃17蛋白及mRNA表达水平均高于Control组，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 结论 SLE患儿外周血中IL⁃6、IL⁃10、IL⁃17蛋白及mRNA表达水平升高，提示其可能参与SLE患儿的发病过程。

系统性红斑狼疮；白介素⁃6；白介素⁃10；白介素⁃17；外周血

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythemato⁃sus，SLE）是一种发病机理复杂的自身免疫性疾病。儿童SLE是一种常见的儿科自身免疫性疾病，与成人相比，儿童SLE临床上的表现更加复杂［4］。目前SLE的发病机制仍不是十分明了，以往的研究主要集中在T淋巴细胞和B淋巴细胞数量和功能的异常上，已有研究证实炎症因子如白介素⁃6（interleukin⁃6，IL⁃6）、IL⁃10、IL⁃17、干扰素⁃α（interferon⁃α，IFN⁃α）等在其发病中起着很重要的作用［2，4］，但目前人们对成人的研究较多而对儿童SLE关注较少，本研究通过检测SLE患儿外周血中 IL⁃6、IL⁃10、IL⁃17 的蛋白水平变化情况及外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中IL⁃6、IL⁃10、IL⁃17的 mRNA 表达情况，初步探讨其在儿童SLE的发病、发展中的作用，以期为其临床诊疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象

SLE组：选取昆明市儿童医院2012年10月至2016年3月收治的SLE儿童患者46例，所有病例采用SLE疾病活动性测量（systemic lupus activity measure，SLAM）监测活动程度，并检测外周血细胞计数、红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、抗核抗体、抗双链DNA 抗体、补体C3、尿液分析、尿蛋白定量（24 h），经检测所有患儿诊断均符合2009年SLE国际临床合作中心（SLE In⁃ternational Center for clinical cooperation，SLICC）、美国风湿病学会（American College of Rheumatolo⁃gy，ACR）在费城年会上提出的新诊断标准，入选病例需排除伴有其他自身免疫性疾病、严重感染及其他患病导致功能异常者［5⁃7］。男 9 例，女 37例，男女比例 1∶4.11，患儿年龄 6～14 岁，平均（11.2±2.7）岁，病程2周至 4年；对照组（Control组）：选取无诊断标准中狼疮临床表现及免疫指标正常的健康儿童20例，男5例，女15例，男女比例 1∶3，年龄6～15 岁，平均（12.6±3.4）岁。两组患儿平均年龄及性别比例差异无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 标本采集

入组儿童均抽取外周肘部静脉血5 mL，其中采集3 mL于无添加剂采血管（红盖）中，2 mL于EDTA⁃K2抗凝管中，无添加剂采血管（红盖）中的血液于室温下静置2 h后取血清储存于-80℃环境中，待ELISA检测。

1.2.2 细胞因子的测定

利用ELISA 方法快速检测血清中IL⁃6、IL⁃10、IL⁃17蛋白含量。ELISA试剂盒购自美国ADL公司。操作步骤如下：①取上述冻存的血清标本，室温冻融后，将试剂盒平衡至室温。②取出试验所需板条。配置标准品：向冻干标准品（IL⁃6、IL⁃10、IL⁃17）中分别加入1.0 mL通用稀释液中，静置15 min后，在常温下轻轻混匀，再根据说明书依次倍比稀释。③加样：每孔加100 μL稀释好的标准品或稀释后的标本，封板后于37℃孵箱中孵育90 min。④待孵育结束后，用自动洗板机（或手动）洗板4～5次。⑤洗板结束后，加100 μL生物素化抗体工作液到每个孔中，封板后于37℃孵箱中孵育60 min。⑥洗板4～5次。⑦每孔加100 μL酶结合物工作液，封板后孵育30 min（于37℃孵箱中，避光）。⑧洗板4～5次。⑨每孔加入100 μL四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）的显色底物，在37℃孵箱中避光孵育15 min。⑩每孔加100 μL终止液，3 min中内使用多功能酶标仪（Alisei Quality System，SEAC，意大利）450 nm 处读取数据，测OD值。○11根据标准品浓度和OD值绘制出标准曲线，根据标本所测的OD值，计算每个标本的浓度。

1.2.3 PBMCs的提取

取收集好的1 mL EDTA⁃K2抗凝血3000 r/min室温离心10 min，弃去上清血浆层，将剩余血液与生理盐水1∶1混匀后，小心加于2 mL淋巴细胞分离液面上，水平离心机上室温离心，3000 r/min，25 min，最后，用吸管小心吸取云雾层，加入1.5 mL EP管中，水平离心机上室温离心，7000 r/min，10 min，弃上清。

1.2.4 PBMCs中IL⁃6、IL⁃10、IL⁃17 mRNA的检测

TRIzol（Invitrogen，美国）法提取 PBMCs总RNA，检测RNA纯度和浓度。参照反转录PCR试剂盒（TaKaRa，日本）使用说明书，按照以下组分配制反转录反应体系：2 μL 5× PrimeScript Buffer，0.5 μL PrimeScript RT Enzyme Mix，0.5 μL Oligo dT Prime（50 μmol/L），0.5 μL Random 6 mers（100 μmol/L），1 μL Total RNA，5 μL RNase Free dH2O。反应条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃，保存。以反转录后的cDNA作为模板，以GAPDH做内参，按照以下组分配制 real time⁃PCR 反应体系：5 μL SsoFast EvaGreen Supermix（2×），0.5 μL Forward primer（10 μmol/L），0.5 μL Reverse primer（10 μmol/L），4 μL cDNA。实时荧光定量PCR（quanti⁃tative real time polymerse chain reaction，qPCR）扩增条件：94℃预变性5 min，90℃变性30 s，60℃退火40 s，72℃延伸40 s，40个循环。通过 Genbank 检索出IL⁃6、IL⁃10和IL⁃17基因序列，输入 Primer Premier 5.0软件设计基因引物，引物合成公司为上海捷瑞生物工程有限公司。实验数据用2⁃△△Ct进行处理。检测IL⁃6、IL⁃10、IL⁃17mRNA 的表达水平，引物序列见表1。

表1 Real time⁃PCR 引物序列Table 1 The primer of real time⁃PCR

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，组间比较行t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SLE组和Control组外周血细胞因子含量比较

如表2所示，与Control组相比较，SLE组外周血中的 IL⁃6、IL⁃10 和IL⁃17水平明显升高，分别达到（32.64±13.32）pg/mL，（54.82±21.44）pg/mL 和（51.92±32.33）pg/mL。与 Control组相比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 各组 PBMCs中 IL⁃6、IL⁃10、IL⁃17 的mRNA 表达水平的比较

如图1所示，与Control组相比较，SLE组PBMCs中IL⁃6、IL⁃10和IL⁃17的 mRNA 表达水平明显升高，与Control组相比较，差异具有统计学意义（P＜ 0.05）。

表2 SLE组和Control组外周血IL⁃6、IL⁃10、IL⁃17水平变化比较 （x±s，pg/mL）Table 2 Expression of IL⁃6、IL⁃10、IL⁃17 in peripheral blood of SLE group and control group（x±s，pg/mL）

3 讨论

IL⁃6是一种多效性细胞因子，是机体免疫网络中重要的细胞因子，主要由单核细胞、成纤维细胞、内皮细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞合成分泌［8］。IL⁃6参与调节免疫应答，血细胞的生成及急性期反应，能够促进与炎症应答相关的B细胞、T细胞、巨噬细胞及中性粒细胞的分化及活化，有研究表明，IL⁃6可通过诱导B淋巴细胞成熟、增殖分化为产生抗体的浆细胞，从而增加免疫球蛋白的分泌；同时促进由T细胞分泌的自身抗体产生以及通过降低CD8+抑制性T细胞的活性而参与SLE 形成［9］。Eilertsen 等［10］和 Umare 等［11］研究发现SLE患者外周血中IL⁃6的水平高于对照组，差异具有统计学意义。吴实等［4］研究发现SLE患者组与对照组外周血IL⁃6浓度分别为（9.636±3.852）pg/mL和（4.433±1.143）pg/mL，SLE组外周血IL⁃6浓度明显高于对照组。朱静等［12］亦发现SLE组血清中IL⁃6水平（6.42±2.08）pg/mL明显高于对照组（2.87±1.33）pg/mL。与朱静等［12］人的研究结果一致，本实验发现，SLE患儿组的外周血IL⁃6浓度为（32.64±13.32）pg/mL，高于对照组（6.13±4.78）pg/mL，差异具有统计学意义。检测其RNA水平，同样发现，SLE患儿组IL⁃6的RNA水平高于对照组RNA的水平，差异具有统计学意义。

图1 SLE组和Control组PBMCs中IL⁃6、IL⁃10、IL⁃17的mRNA表达情况Figure 1 Expression ofIL⁃6、IL⁃10、IL⁃17mRNA in PBMCs of SLE group and Control group

Th17细胞是一群新型的CD4+T细胞，IL⁃17为其发挥免疫调节功能的主要效应因子［13］，能够强效促炎。IL⁃17除了具有其潜在的促炎因子作用，还可诱导髓样细胞、上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞等多种细胞产生不同炎症介质，如IL⁃6、IL⁃8、角质细胞诱导物（keratinocyte，KC）、粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating fac⁃tor，G⁃CSF）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的趋化因子（chemokines，CXC）等［14］，从而引发局部或全身的炎症反应。以往动物实验发现IL⁃17和Th17细胞在SLE的发病中起着重要作用［15］。Mok等［16］和 Gigante等［17］研究发现在 SLE 患者外周血中，IL⁃17的表达水平明显升高，这提示了IL⁃17可能参与SLE的发病过程。董大群［18］研究发现SLE活动期患者外周血中IL⁃17浓度为（87.59±23.54）pg/mL，比SLE非活动期患者和正常人外周血IL⁃17浓度明显升高。而白雪等［19］研究发现SLE活动期、非活动期患者和对照组外周血IL⁃17浓度分别为（32.16±20.23）g/mL、（57.45±17.93）pg/mL和（41.32±13.25）pg/mL，SLE患者体内 IL⁃17水平较对照组有明显升高，且与疾病活动明显相关。本实验中发现，与对照组相比，SLE患儿外周血IL⁃17蛋白浓度和PBMCsIL⁃17mRNA水平明显升高，这与董大群等人的结果一致。

Th1/Th2比例失衡可导致一系列免疫疾病的产生。系统性红斑狼疮是一种以Th2细胞过度活化为主的Th1/Th2比例失衡产生的免疫性疾病。目前有研究表明，Th2型细胞因子的过度产生可能会造成SLE患者体液免疫功能亢进，多克隆B细胞活化以及产生大量器官非特异性抗体，从而造成SLE 患者多个组织器官的损害［15⁃16］。IL⁃10 属Th2型因子的一种，在SLE中表达较高，其在SLE中作用主要是促进B细胞的分化，并产生自身抗体，诱导B细胞向浆细胞分化，从而参与控制向IgG1和 IgG3 亚型的转换［1］。宫泽琨等［20］研究发现SLE患者外周血清IL⁃10浓度为（50.38±5.59）pg/mL，其浓度高于对照组（26.67±6.32）pg/mL，差异具有统计学意义。朱强等［21］研究发现SLE患者外周血清IL⁃10浓度为（146.66±18.69）pg/mL，缓解期患者为（118.05±16.95）pg/mL，高于健康人的（85.45±14.95）pg/mL，差异具有统计学意义；且在SLE患者中轻度活动组外周血清IL⁃10浓度为（135.27±19.24）pg/mL，中度活动组（148.47±14.99）pg/mL，重度活动组（162.06±13.67）pg/mL，与 系统性红斑狼疮病活动指数（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）评分呈正相关，提示 IL⁃10参与SLE的发病过程。与前人研究结果一致［18］，本实验也发现与对照组相比，SLE患儿外周血中IL⁃17蛋白的浓度和PBMCsIL⁃17mRNA水平上升，差异具有统计学意义。

综上所述，本研究结果显示SLE患儿外周血中IL⁃6、IL⁃10、IL⁃17蛋白及 PBMCs中IL⁃6、IL⁃10、IL⁃17的mRNA表达水平均明显高于正常儿童，结果与以往成人SLE患者的研究结果相似［3］，提示IL⁃6、IL⁃10、IL⁃17 这3种炎性因子的表达异常可能预示着SLE患儿的发病。因此，IL⁃6、IL⁃10、IL⁃17这3种炎性因子的表达异常或许可以成为判断SLE患儿是否发病的良好指标，但其发病的具体作用机制与成年SLE患者是否一致，与SLE活动程度是否具有相关性等问题仍需要进行进一步深入研究。了解这些细胞因子的异常有助于我们了解SLE患儿的发病，以及发现发展有效靶向治疗。

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The expression of IL⁃6,IL⁃10 and IL⁃17 in peripheral blood and their mRNA in peripheralblood mononuclearcellsfrom children with systemiclupus erythematosus

SHEN Ru1★,LI Yanjun2,LIN Lijia3
（1.Laboratory Department,Kunming Children's Hospital,Kunming,Yunnan,China,650228;2.Kunming City Center for Disease Control and Prevention,Kunming,Yunnan,China,650011;3.Science and Education Division,Kunming Children's Hospital,Kunming,Yunnan,China,650228）

Objective To investigate the interleukin⁃6(IL⁃6),interleukin⁃10(IL⁃10)and interleukin⁃17(IL⁃17)in peripheral blood from children with systemic lupus erythematosus(SLE),and detect the expression ofIL⁃6,IL⁃10andIL⁃17mRNA in their peripheral blood mononuclear cells(PBMCs). Methods The levels of IL⁃6,IL⁃10 and IL⁃17 were detected by enzyme⁃linked immunosorbent assay(ELISA)in 46 children with SLE(SLE group)and 20 healthy children(Control group),and the mRNA levels in PBMCs were detected by quantitative real time polymerse chain reacton(qPCR). Results The protein and mRNA levels of IL⁃6,IL⁃10 and IL⁃17 in SLE group were significantly higher than those in Control group(P＜0.05). Conclusion The levels of IL⁃6,IL⁃10 and IL⁃17 proteins and mRNA in peripheral blood of children with SLE increased,suggesting that IL⁃6,IL⁃10 and IL⁃17 may be involved in the pathogenesis of SLE in children.

Systemic lupus erythematosus;IL⁃6;IL⁃10;IL⁃17;Peripheral blood

1.昆明市儿童医院检验科，云南，昆明650228

2.昆明市疾病预防控制中心，云南，昆明650011

3.昆明市儿童医院科教科，云南，昆明650228

★通讯作者：沈茹，E⁃mail：shenru2009@163.com