直接快速多色荧光PCR技术在高危型HPV分型中的应用探讨

刘淑园 肖湘文 丁渭 曾烨 张天海 王盼盼 陈华云

直接快速多色荧光PCR技术在高危型HPV分型中的应用探讨

刘淑园 肖湘文 丁渭 曾烨 张天海 王盼盼 陈华云★

目的 探讨直接快速多色荧光PCR技术在高危型人乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染分型检测中的应用。 方法 对2014年3月至2014年10月794例患者宫颈粘液样本，采用直接快速多色荧光PCR技术与传统荧光PCR技术同步进行HPV分型检测，并对比分析。对于检测试剂与对比试剂检测结果不一样的样本，采取测序法复核。选择中国生物制品检定研究院HPV标准品进行18种HPV型别最低检出量和特异性分析。同时测试直接快速多色荧光PCR技术在AB7500FAST、Bio⁃Rad CFX96、Roche480、AGS9600等多种荧光扩增仪上的扩增效果并进行比较。 结果 794例样本中，检测试剂检出高危型HPV阳性患者600例，阴性样本194例。对比试剂检出HPV阳性患者595例，阴性样本199例。直接快速多色荧光PCR技术检测HPV的18个型别的最低检测量在100～1000 copies/mL之间；在AB7500FAST、Bio⁃Rad CFX96、Roche480、AGS9600等仪器的比对分析中，Bio⁃Rad CFX96检测结果表现最佳。Roche480反应时间最长，本底相对较高。国产安杰思AGS9600仪器检测与AB7500持平居中。 结论 直接快速PCR技术无需核酸提取，样本直接进行快速PCR扩增，检测时间短，反应速度快，特异性高，重复性好，试剂本身带有颜色示踪，对于解决我国临床HPV检测的普及具有重要意义。

人乳头状瘤病毒；基因分型；直接快速多色荧光PCR；宫颈上皮内瘤变（CIN）

宫颈癌是女性第二大癌症，主要病因是由高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的持续和反复感染所致。HPV感染同99.7%的子宫颈癌相关，约70%的成年女性一生中会被HPV感染，从被感染到宫颈癌发病间期可长达20年，全世界每年新增50万例，死亡27.5万例，亚洲23.5万例，中国估计有近10万新发病例，约占世界新发病例总数的1/5［1］。致癌性高危HPV基因型的持续感染与宫颈癌发生密切相关［2⁃3］。与未感染HPV的女性相比，感染HPV16和感染HPV18后，患宫颈鳞状细胞癌的风险分别要高出约400倍和250倍［1］。我国城市妇女由于缺乏有组织的筛查计划和医学知识，每年约有3万名妇女死于子宫颈癌［4］。中高危型HPV与宫颈癌及宫颈上皮内瘤样病变（cervical in⁃traepithelial neoplasia，CIN2/3）的发生密切相关［5］。HPV DNA检测还可以对难以确定的不典型鳞状上皮细胞（atypical squamous cells，ASCUS）和宫颈脱落细胞轻度病变作进一步的判断［6］。2015年美国妇科肿瘤学会（Society of Gynecologic Oncology，SGO）/美国阴道镜和宫颈病理学会（American Soci⁃ety for Colposcopy and Cervical Pathology，ASCCP）在针对宫颈癌初筛的指南中指出，高危型HPV检测可以作为一线宫颈癌初筛方案［7⁃9］。现有的运用荧光PCR方法进行高危型人乳头瘤病毒基因分型检测的技术的缺点主要是扩增灵敏度低，耗时长。前期一般都需要经过步骤繁琐的核酸提取，然后运用普通Taqman探针的方法进行多重PCR扩增，而且一般都是FAM和HEX两通道检测，无法具体区分高危HPV型别，难以满足实际使用的需要。直接快速多色荧光PCR技术只需对样本进行简单的处理即可上样，反应时间短，同时可以检测13种常见高风险 HPV 基因型（31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82）和3种少见高风险HPV 基因型（26、53、73），还能具体分型高风险HPV 基因型16型和18型。本研究采用直接快速多色荧光PCR技术与传统荧光PCR技术同步进行HPV分型检测，并对比分析，探讨直接快速荧光PCR技术在高危型HPV感染分型检测中的应用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

2014年3月至2014年10月来自南方医科大学南方医院、大连医科大学附属第一医院、中国人民解放军兰州军区乌鲁木齐总医院就诊的经临床确诊为HPV感染的794例患者，对其宫颈脱落细胞、生殖泌尿道分泌物取样后封装保存的宫颈刷、拭子或大于1 mL的细胞保存液进行检测分析。

1.2 试剂与仪器

直接快速多色荧光PCR技术使用的试剂来自于广州和实生物技术有限公司研制的高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒（PCR⁃荧光探针法），该试剂盒采用的检测方法为多重荧光PCR方法，特异性检测HPV18种高度危险型别（16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82），并可通过分析荧光来区分HPV16型（HEX标记）和HPV18型（TEXRD标记）（剩余16个基因型用FAM标记，Globin基因作为检测内标用CY5标记）。传统荧光PCR技术使用的试剂来源于广州安必平医药科技有限公司的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法），该试剂为两通道检测。18种HPV型别最低检出量的标准品来源于中国生物制品检定研究院HPV标准品。特异型分析样本为4例生殖道病原体阳性样本，分别感染如下病原体：梅毒螺旋体（Treponema Pallidum）、淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae）、白色念珠菌（Monil⁃ia albican）、阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis），且均经相应的试剂盒确认为相应病原体阳性且无HPV感染，其中梅毒螺旋体、淋球菌、白色念珠菌的浓度为106CFU/mL，阴道毛滴虫浓度为106个/mL。PCR 扩增仪器为 AB7500FAST、Bio⁃Rad CFX96、Roche480、AGS9600荧光扩增仪。

1.3 方法

1.3.1 样本的处理

直接快速多色荧光PCR技术样本的处理：临床样本和另外4例生殖道病原体阳性样本用灭菌生理盐水清洗2次后离心弃上清，悬浮细胞沉淀备用；HPV标准品梯度稀释为50 copies/mL、100 copies/mL、500 copies/mL、1000 copies/mL、10000 copies/mL后备用。

传统PCR技术样本的处理：将794例临床样本用病毒核酸提取试剂提取核酸备用。

1.3.2 检测方法

1.3.2.1 直接快速多色荧光PCR技术检测方法

临床样本检测方法：将离心处理好的794例临床样本分别加入直接快速多色荧光PCR扩增体系，设置扩增条件，在AB7500上进行扩增。

最低检出量检测方法：将梯度稀释好（分别为50 copies/mL、100 copies/mL、500 copies/mL、1000 copies/mL、2000 copies/mL）的 18个型别的 HPV标准品，分别加入直接快速多色荧光PCR扩增体系，设置扩增条件，在AB7500上进行扩增。

特异性检测方法：选择另外4例生殖道病原体阳性样本，分别加入直接快速多色PCR扩增体系，设置扩增条件，在AB7500上进行扩增，检测其特异性。

不同机型测试方法：选择稀释后的中国生物制品检定研究院的HPV标准品，采用直接快速多色荧光PCR技术检测其在AB7500FAST、Bio⁃Rad CFX96、Roche480、AGS9600等多种荧光扩增仪上的扩增效果并进行比较。

重复性检测方法：选择全部18种基因型质粒和随机选取5个临床样本重复进行3次试验，设置扩增条件，在AB7500上检测其重复性。

1.3.2.2 传统PCR技术检测方法

将提取好794例患者宫颈粘液样本的核酸分别加入传统PCR扩增体系，设置扩增条件，在AB7500上进行扩增。

1.3.3 反应条件

直接快速多色PCR反应条件为：50℃3 min；95℃ 5 min；95℃ 5 s 56℃ 16 s（采集荧光），45个循环。

传统PCR反应条件为：95℃15 min；94℃15 s 55℃ 45 s（采集荧光），45个循环。

1.4 结果分析

阳性判断：荧光曲线与内标（CY5标定）曲线均成S型生长；阴性判定：仅内标（CY5标定）曲线成S型生长。

1.5 统计学处理

采用SPSS 12.0统计软件建立数据库进行统计分析。本次研究采用Kappa检验，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 直接快速多色荧光PCR技术检测试剂性能参数分析

对中国生物制品检定研究院HPV标准品进行梯度稀释后，同时进行特异性和灵敏度分析。结果4例特异性检测样本均为阴性，试剂特异性良好。针对18个基因型的最低检出量分析如表1所示，部分基因型检测示意图如图1所示。本研究对试剂的重复性进行了分析，选择全部18种基因型质粒和5个临床样本进行试验，所有结果变异系数低于5%，表明试剂具有良好的重复性。

表1 18个高危型HPV病毒最低检出量Table 1 The minimum detection volume of 18 types of high risk HPV

图1 直接快速多色荧光HPV检测扩增示意图Figure 1 The amplification diagram of direct rapid fluorescence HPV detection

2.2 AB7500FAST/Bio⁃Rad CFX96/Roche480/AGS 9600等机型反应时间和结果表现

通过对不同机型上机开始到实验结束下机时间的总体计算，在 AB7500FAST、Bio⁃Rad CFX96、Roche480、AGS9600等机型上反应时间分别为1 h 10 min、1 h 5 min、1 h 20 min、1 h 10 min，相对于传统荧光PCR检测3.5 h，整个时间缩短了约一半，极大提高了检测的效率。在AB7500FAST、Bio⁃Rad CFX96、Roche480、AGS9600检测的比对分析中，Bio⁃Rad CFX96检测结果表现最佳，时间最短，曲线平滑，本底最低。Roche480在进行多色检测时，反应时间最长，由于软件本身需要进行通道选择，导致部分荧光检测信号相对不佳，本底较高。国产安杰思AGS9600仪器检测已经可以达到进口仪器水平。所有仪器的重复性均满足要求。

2.3 临床样本结果分析

本次研究采用随机、盲法的临床试验设计，共检测样本794例，本研究试剂检测到600例阳性样本，194例阴性样本。对照试剂检测到595例阳性样本，199例阴性样本。与对照试剂相比，本次研究所用试剂的阳性符合率为100%，阴性符合率为92.82%，总符合率为98.11%，Kappa值为0.950（P=0.000），表明待考评试剂盒与对照试剂盒具有很好的一致性。有5例临床样本对照试剂检测阴性，经过GP5/GP6引物扩增并测序验证［11］，对照试剂存在漏检的情况。进一步对全部595例阳性样本的实验结果进行分析，其中16型（含混合感染）占22.6%，18型（含混合感染）占10.8%。

3 讨论

宫颈癌是严重危害妇女健康的恶性肿瘤之一，其具有较长的癌前病变阶段。人乳头状瘤病毒感染是宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的主要病因［11］。HPV感染率随着宫颈病变进展而升高，高危型HPV基因型是宫颈癌变的早期事件，多重感染是加重宫颈病变的重要因素［12］。已有国内外研究表明，宫颈癌99%以上是由如下8种高危HPV亚 型 引 起 ：HPV16、HPV18、HPV45、HPV31、HPV33、HPV52、HPV58、HPV67，其 中 HPV16、HPV18、HPV45、HPV31 是主要高危型，HPV33、HPV52、HPV58、HPV67 是次要高危型［13⁃14］。但在国内，HPV16、HPV52、HPV58、HPV45 发病率较高。这8种以外的其他高危型，属于伴随感染，不会独立于以上8种型别存在。

随着光电技术的发展和荧光PCR技术的不断进步，已经出现了可不用样本核酸提取的直接PCR技术和基于仪器平台的快速PCR技术，这2种技术代表了目前PCR发展的新方向［15⁃16］。本研究采用的直接快速荧光PCR技术属于不提取核酸的直接PCR技术，使用新一代FAST⁃Taq DNA聚合酶，该酶通过基因工程改造和化学修饰，聚合酶同时具有热启动、快速扩增和耐抑制物特性，热启动保证了反应的敏感度和特异性、快速扩增使得检测时间大大缩短，耐抑制物使得反应体系可以对含血样本进行扩增不影响结果，具有极大的应用前景。

进一步，本研究采用多通道荧光定量PCR技术检测HPV DNA，通过使用多种具有不同激发或发射波长的荧光物质标记不同或通用特异性探针进行示踪，从而实现在同一反应管内对不同基因型别进行检测。本研究针对WHO推荐的全部18种高风险HPV基因型进行筛查分型，同时对最高危的16、18型进行细分，一次检测满足多种需要。同时，本方法在有质粒梯度一起检测的模式下，还可以对检测样本存在的病毒滴度进行定量分析。通过本研究证实，直接快速多色荧光PCR技术检测HPV DNA灵敏度高、重复性好、分型的同时还可以准确定量，结果直观可靠，客观性强，临床应用前景好。

总之，基于直接快速多色荧光PCR技术进行HPV全部高危型检测分析，检测速度快、特异性好、灵敏度高、重复性高、试剂本身带有指示剂，对于临床HPV检测的普及具有重大价值。

［1］ de Sanjose S，Quint WG，Alemany L，et al.Human papillomavirus genotype attribution in invasive cervical cancer：a retrospective cross⁃sectional worldwide study［J］.Lancet Oncol，2010，11（11）：1048⁃1056.

［2］ Walboomers JL，Jacobs MV，Manos MM，et al.Hu⁃man papillomavirus is a necessary cause of invasive cervicalcancer worldwide［J］.J Pathol，1999，189（1）：12⁃19.

［3］ Bosch FX，Lorincz A，Muñoz N，et al.The causal rela⁃tion between human papillomavirus and cervical cancer［J］.J Clin Pathol，2002，55（4）：244⁃265.

［4］ 王春红，杜娟，王永霞.重视宫颈癌的早期症状与高危人群的筛查［J］.医学信息，2015（38）：220⁃220.

［5］ Bouvard V，Baan R，Straif K，et al.A review of hu⁃man carcinogens ⁃Part B：biological agents［J］.Lancet Oncol，2009，10（4）：321⁃322.

［6］ Katki HA，Kinney WK，Fetterman B，et al.Cervical cancer risk for women undergoing concurrent testing for human papillomavirus and cervical cytology：a pop⁃ulation⁃based study in routine clinical practice［J］.Lan⁃cet Oncol，2011，12（7）：663⁃672.

［7］ Huh WK，Ault KA，Chelmow D，et al.Use of primary high⁃risk human papillomavirus testing for cervical can⁃cer screening：Interim clinical guidance［J］.Gynecol Oncol，2015，136（2）：178⁃182.

［8］ Huh WK，Ault KA，Chelmow D，et al.Use of primary high⁃risk human papillomavirus testing for cervical can⁃cer screening：interim clinical guidance［J］.Obstet Gy⁃necol，2015，125（2）：330⁃337.

［9］ Wright TC，Stoler MH，Behrens CM，et al.Primary cervical cancer screening with human papillomavirus：end of study results from the Athena study using HPV as the first⁃line screening test［J］.Gynecol Oncol，2015，136（2）：189⁃197.

［10］ Qu W，Jiang G，Cruz Y，et al.PCR detection of hu⁃man papillomavirus：comparison between MY09/MY11 and GP5+/GP6+primer systems［J］.J Clin Mi⁃crobiol，1997，35（6）：1304⁃1310.

［11］ 代红莹，张晓静.重庆永川地区人乳头瘤病毒感染亚型、年龄分布及多重感染影响的研究［J］.重庆医学，2013，42（6）：619⁃621.

［12］ 唐忠辉，黄仲庆，孟加榕，等.24种HPV基因型检测在宫颈病变诊断中的意义［J］.中国民康医学，2015（9）：8⁃10.

［13］ Castle PE，Schiffman M，Wheeler CM，et al.Impact of improved classi fi cation on the association of human papillomavirus with cervical precancer［J］.Am J Epide⁃miol，2010，171：155⁃163.

［14］ 乔友林.中国妇女人乳头瘤病毒感染和子宫颈癌的流行病学研究现状及其疫苗预防前景［J］.中华流行病学杂志，2007，28（10）：937⁃940.

［15］ Zhang Z，Kermekchiev MB，Barnes WM.Direct DNA amplification from crude clinical samples using a PCR enhancer cocktail and novel mutants of Taq［J］.J Mol Diagn，2010，12（2）：152⁃161.

［16］ Arezi B，McKinney N，Hansen C，et al.Compartmen⁃talized self⁃replication under fast PCR cycling condi⁃tions yields Taq DNA polymerase mutants with in⁃creased DNA⁃binding affinity and blood resistance［J］.Front Microbiol，2014，5：408.

Application of direct and rapid multi⁃color fluorescence PCR in high risk HPV typing

LIU Shuyuan，XIAO Xiangwen，DING Wei，ZENG Ye，ZHANG Tianhai，WANG Panpan，CHEN Huayun★（Guangzhou HEAS BioTech Co.，Ltd，Guangzhou，Guangdong，China，510700）

Objective To explore the application of direct and rapid multi⁃color fluorescence PCR in the detection of high risk human papillomavirus(HPV)infection. Methods From March 2014 to October 2014,cervical mucus samples from 794 patients were detected by direct and rapid multi⁃color fluorescence PCR and traditional fluorescence PCR for HPV typing comparison.If the results are not consistent when compared with detection reagents(multi⁃color flourescence PCR)and control reagents(traditional fluorescence PCR),the sequencing method was used for verification.The minimum detectable range and specific analysis of 18 types of HPV from National Institute for Biological products were confirmed.In addition,the amplification efficiency of direct rapid multi⁃color fluorescence PCR were tested and compared in the instruments of AB7500FAST、Bio⁃Rad CFX96、Roche480、AGS9600. Results 600 positive samples and 194 negative samples were determined by the multi⁃color fluorescence PCR(detection reagents)in the sum of 794 samples.595 positive samples and 199 negative samples were determined by the traditional fluorescence PCR(control reagents).The minimum detection of 18 types of HPV with direct and fast multi⁃color PCR were located between 100～1000 copies/mL.Compared with the test results of fluorescence amplification from AB7500FAST,Roche480 and AGS9600,Bio⁃Rad CFX96 is the best.The reaction time of Roche480 is the longest and the background is relatively high.AGS9600 and AB7500 are in the middle levels. Conclusion Direct and rapid multi⁃color fluorescence PCR technology does not require nucleic acid extraction.The detection time is short,rapid reaction,high specificity,good repeatability,and reagent itself with color tracing.It is of great importance to popularize the clinical HPV detection in China.

Human papillomavirus;HPV genotyping;Direct and rapid multi⁃color fluorescence PCR;Cervical intraepithelial neoplasias

广州和实生物技术有限公司，广东，广州510700

★通讯作者：陈华云，E⁃mail：chy@heasbio.com