离子液体为流动相添加剂高效液相色谱法同时测定莲子心中莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱①

王红敏 唐 岩 孙爱玲 柳仁民,

(1.聊城大学 药学院，山东 聊城 252059; 2.聊城大学 化学化工学院，山东 聊城 252059)

离子液体为流动相添加剂高效液相色谱法同时测定莲子心中莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱①

王红敏1唐 岩2孙爱玲2柳仁民1,2

(1.聊城大学 药学院，山东 聊城 252059; 2.聊城大学 化学化工学院，山东 聊城 252059)

采用离子液体作为反相高效液相色谱流动相添加剂，建立了同时测定莲子心中莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱含量的方法.色谱柱为SPHERIGEL ODS C18 (250 mm× 4.6 mm I.D., 5 μm)，流动相为添加30 mmol/L [HMIM][BF4]、pH为3.0的甲醇/水(70/30, v/v)，流动相流速为1.0 mL/min，检测波长为280 nm.在浓度范围为2-200 μg/mL范围内，莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的线性相关系数分别为0.999 8，0.999 7和0.999 8；对莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的LOD分别为0.14 mg/L、0.17 mg/L和0.19 mg/L，LOQ分别为0.29 mg/L、0.35 mg/L和0.41 mg/L.

离子液体,流动相添加剂,莲子心,生物碱,反相高效液相色谱法

0 引言

莲子心为睡莲科植物莲的成熟种子中干燥的幼叶及胚根，现代药学研究和临床试验表明莲子心具有抗心律失常、抗癌、抗血小板聚集、降压和抗脂质过氧化及清除自由基等多种药理作用[1-5].莲子心中的主要活性成分为生物碱类物质，如莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱等，其结构如图1所示.因此，建立同时测定莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱含量的方法对于莲子心的药学研究和质量控制具有十分重要的意义.

在通常的反相高效液相色潽(RP-HPLC)流动相的pH范围内(3.0

图1 莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的结构

离子液体是一种由体积相对较大的有机阳离子和有机或无极阴离子构成，室下温为液体的盐，具有较高的离子迁移率、非常低的蒸气压、不易燃性以及很好的化学稳定性[9]等独特的物理化学性质，它可以作为环境友好溶剂而受到人们的广泛关注，并被应用于气相色谱固定相[10,11]、作为液相色谱固定相[12,13]以及作为液相色谱流动相添加剂[14-19].然而，目前还没有关于应用离子液体作为反相高效液相色谱流动相添加剂来分离和测定莲子心中的莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的报道.

本文对离子液体烷基链长度和阴离子种类、离子液体浓度及流动相的pH值对RP-HPLC分离测定莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的影响进行了研究，建立了应用1-烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体作为流动相添加剂，同时测定莲子心中莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱含量的RP-HPLC方法，对方法的精密度、准确度等进行考查，并且实际应用于莲子心中莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱含量的测定，结果满意.

1 实验部分

1.1 仪器

安捷伦1100高效液相色谱仪(Agilent Technologies, Germany)，包括：G1311A型四元泵、G1322A型在线脱气装置、G1315B型二极管阵列检测器、7725i型进样器及安捷伦高效液相色谱工作站.FZ102微型植物粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)；SK3300LH超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；UB-7型pH计(北京Denver Instruments仪器有限公司).

1.2 试剂与标准品

图2 不同流动相添加剂分离色谱图注：甲醇/水(70/30，v/v) 含 (A) 30 mmol/L的三乙胺；(B) 30 mol/L [EMIM][BF4]；(C) 30 mmol/L [BMIM][BF4]；(D) 30 mmol/L [HMIM][BF4]；(E)30 mmol/L [HMIM][Cl].1：莲心碱；2：异莲心碱；3：甲基莲心碱.

莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱标准品均购于中国药品生物制品检定所(北京，中国).本实验所使用的离子液体：1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM][BF4])、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([BMIM][BF4])、1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([HMIM][BF4])和1-己基-3-甲基咪唑氯盐([HMIM][Cl])，购于兰州化学与物理研究所(纯度>99%).HPLC分析所用甲醇为色谱纯(禹城化工厂)，所用水为纯净水.实验中所用的其他试剂均为分析纯，所用水为二次蒸馏水.

莲子心药材：样品1产地中国南京，样品2产地中国江西，样品3产地中国浙江，均购于安徽毫州药材市场，经山东中医药大学张永清教授鉴定为正品药材.

1.3 HPLC色谱条件

色谱柱为SPHERIGEL ODS C18(250 mm × 4.6 mm ID. 5 μm)，流动相为含有30 mmol/L [HMIM][BF4]、pH为3.0的甲醇/水 (70:30,v/v)溶液，流动相流速为1.0 mL/min，检测波长为280 nm，进样量为20 μL，柱温为室温.

1.4 样品溶液的制备

将干燥的莲子心用植物粉碎机粉碎至约为40目，称取0.20 g的莲子心粉末，加入40 mL的甲醇溶液超声30 min，将超声后的溶液以4 000 rpm的转速离心15 min，将上清液转移到50 mL的容量瓶中，用甲醇溶液定容，摇匀，最后经0.45 μm微孔滤膜过滤.

2 结果与讨论

2.1 离子液体的选择

在利用RP-HPLC法分析碱性化合物时，通常会使用三乙胺作为流动相添加剂.因此，本实验首先研究了三乙胺对分离莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的影响，并将实验结果与离子液体进行比较，有关色谱图见图2.由图2可见，当使用离子液体作为流动相添加剂时，分析物的保留时间、分离效率、分离度以及色谱峰的对称性都得到了显著的改善.

表1列出了不同烷基链长度的离子液体作为流动相添加剂时，莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的保留因子、分离度及理论塔板数.由表1可见，对于具有相同阴离子的离子液体，随着烷基链长度的增加，莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的保留降低了，并且色谱峰形也得到了显著的改善.由此可以清楚地表明，使用[HMIM][BF4]作为流动相添加剂可以提供好的分离效果以及短的保留时间.

表1同时列出了[HMIM][BF4]和[HMIM][Cl]作为流动相的添加剂时，莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的保留因子、分离度及理论塔板数.从表1可以看出，当[HMIM][BF4]作为流动相的添加剂时，可以获得好的分离结果以及高的分离效率.故在后续实验中使用[HMIM][BF4]作为流动相添加剂.

表1 离子液体作为流动相添加剂时莲子心生物碱保留因子、分离度及理论塔板数

注：1. 莲心碱，2. 异莲心碱， 3. 甲基莲心碱

2.2 [HMIM][BF4]浓度的影响

图3 [HMIM][BF4]的浓度对保留因子的影响注：1：莲心碱；2：异莲心碱；3：甲基莲心碱

研究了不同浓度的[HMIM][BF4]作为流动相添加剂对分离莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的影响，实验结果见图3.由图3可见，当向流动相中添加6 mmol/L的[HMIM][BF4]后，莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的保留因子即急剧降低，随着流动相中[HMIM][BF4]浓度的进一步增加，莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱保留因子的降低趋势逐渐减缓，当[HMIM][BF4]的浓度达到30 mmol/L后，保留因子只有微小的变化.因此，在后续的实验中选择[HMIM][BF4]的浓度为30 mmol/L.

2.3 流动相pH的影响

流动相的pH对莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的分离也有重要的影响.众所周知，在通常的RP-HPLC流动相pH范围内(3

图4 流动相的pH值对保留因子的影响注：1：莲心碱；2：异莲心碱；3：甲基莲心碱

2.4 离子液体作为添加剂的可能分离机制

当离子液体作为流动相添加剂时，莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的保留时间、分离效率、分离度以及色谱峰的对称性都得到了显著的改善.这种分离机制可能归结为离子液体在RP-HPLC中的双重性质.当离子液体作为流动相添加剂时，它会在色谱体系中同时发生一系列的变化.一方面，可能会导致咪唑阳离子与分析物的极性官能团通过静电作用相互竞争固定相表面残余的硅羟基.另一方面，离子液体的阴离子可以通过疏水作用与固定相相结合，从而吸附在固定相表面.因此，离子液体作为添加剂的分离机制是一种复合机制，主要包括：离子对形成、离子交换、静电作用以及疏水作用[20].

同时，当离子液体作为流动相添加剂时，离子液体可以有效地覆盖固定相表面残余的硅羟基，并且有效地改善了莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的色谱峰峰形.因此，离子液体可以作为一种合适的环境友好替代剂来有效地降低或抑制残余硅羟基的活性.

2.5 方法验证

2.5.1 线性.在最佳的RP-HPLC条件下，在浓度范围为2-200 μg/mL之间，测定了7种不同浓度的莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的标准溶液.在所测定范围内莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的线性相关系数分别为0.999 8，0.999 7和0.999 8，这说明被测物浓度与其相应峰面积之间具有良好的线性关系.

2.5.2 检出限(LOD)和定量限(LOQ).在优化的色谱条件下，通过检测一系列稀释的标准溶液，以信噪比为3测定了方法的检出限(LOD)，以信噪比为3测定了方法的定量限(LOQ).对于莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱，方法的LOD分别为0.14、0.17和0.19 mg/L，LOQ分别为0.29、0.35和0.41 mg/L.

2.5.3 精密度、准确性和重现性.用日内和日间的变化对方法的精密度进行了评价.重复分析已知浓度的标准溶液6次，莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的日内相对标准偏差分别为1.39%、1.15%和1.27%.在连续3天的日间实验中，莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的日间相对标准偏差分别为1.53%、1.38%和1.46%.相对标准偏差均小于3%.

向已知莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱含量的样品中加入不同浓度的标准品测定了方法的回收率，实验结果见表2.由表2 可见，本法的回收率在98%-102%之间，相对标准偏差小于3%.

表2 本法的回收率(n=3)

2.6 实际样品测定

应用本法对产地分别为南京、江西和浙江的三种莲子心样品中莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的含量进行了测定，结果见表3.图5为产地为南京的莲子心样品色谱图.从图5可以看出，当离子液体作为流动相添加剂时，莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的色谱峰形良好，并且观察不到明显的干扰峰，新建立的RP-HPLC方法可以成功地应用于莲子心样品生物碱的定量分析中.

表3 不同产地莲子心样品中莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的含量

图5 南京产莲子心样品的色谱图注：1：莲心碱；2：异莲心碱；3：甲基莲心碱.

3 结论

本文研究了离子液体咪唑环上烷基链的长度和阴离子的种类、离子液体的浓度和流动相的pH值对莲子心中莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱分离的影响.通过使用[HMIM][BF4]作为流动相添加剂，建立了一种同时测定莲子心中莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱含量的RP-HPLC法.更为重要的是，[HMIM][BF4]不仅可以作为液相色谱流动相添加剂来改善莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的分离，对于其他样品的RP-HPLC分析，也很有发展前景.

[1] 杨健，何文，张贤华. 莲心季胺碱药理作用研究[J]. 广东药学院学报，1999, 15(3): 183-185.

[2] 王嘉陵，农艺，姚伟星，等. 莲心碱对豚鼠心室肌细胞动作电位及钠与钙电流的影响[J].中草药，2000, 31(3): 193-196.

[3] 史霄燕，胡文淑. 甲基莲心碱对高脂血症患者及健康成人血小板聚集的影响[J]. 中国药理学通报，1998, 14(3): 237-239.

[4] 贾菊芳，敖明章，胡本容，等. 甲基莲心碱对脂质过氧化和活性氧自由基的作用[J]. 同济医科大学学报，1994, 23(1): 62-64.

[5] 石书红，庄英帜，曹建国. 甲基莲心碱对长春新碱诱导人胃癌细胞凋亡的影响[J]. 中国药理学通报，2003, 19(8): 928-930.

[6] 赵立波，金悠，王嘉陵. RP-HPLC同时测定莲心总碱中的3种生物碱含量[J]. 中国中药杂志，2007, 32(17): 1 768-1 770.

[7] 陈怡，罗顺德，宋金春，等. 莲子心中酚性生物碱3种主要成分定量分析及其特征图谱研究[J]. 中国医院药学杂志，2004, 24(4): 205-208.

[8] 涂霞，商晶，薛炎，等. 2种HPLC检测器测定莲子心中3种酚性生物碱含量的比较[J].京中医药大学学报，2011, 27(1): 69-72.

[9] Welton T. Room-temperature ionic liquids. Solvents for synthesis and catalysis[J].Chem Rev, 1999, 99: 2 071-2 084.

[10] Armstrong D W, He L, Liu Y S. Examination of ionic liquids and their interaction with molecules, when used as stationary phases in gas chromatography [J].Anal Chem, 1999, 71(17): 3 873-3 876.

[11] Anderson J L, Ding J, Welton T, et al. Characterizing ionic liquids on the basis of multiple solvation interactions [J].J Am Chem Soc, 2002, 124(47): 14 247-14 254.

[12] Sun Y, Cabovska B, Evans C E, et al. Retention characteristics of a new butylimidazolium-based stationary phase [J].Anal Bioanal Chem, 2005, 382(3): 728-734.

[13] Qiu H D, Jiang S X, Liu X. N-Methylimidazolium anion-exchange stationary phase for high-performance liquid chromatography[J]. J Chromatogr A, 2006,1 103(2): 265-270.

[14] Tang F, Tao L, Luo X B, et al. Determination of octopamine, synephrine and tyramine in Citrus herbs by ionic liquid improved ‘green’chromatography [J].J Chromatogr A, 2006, 1 125(2): 182-188.

[15] He L J, Zhang W Z, Zhao L, et al. Effect of 1-alkyl-3-methylimidazolium-based ionic liquids as the eluent on the separation of ephedrines by liquid chromatography [J].J Chromatogr A, 2003, 1 007(1): 39-45.

[16] Zhang W Z, He L J, Gu Y L, et al. Effect of ionic liquids as mobile phase additives on retention of catecholamines in reversed-phase high-performance liquid chromatography [J].Anal Lett, 2003,36(4) :827-838.

[17] Ruiz-Angel M J, Carda-Broch S, Berthod A. Ionic liquids versus triethylamine as mobile phase additives in the analysis of [beta]-blockers [J].J Chromatogr A, 2006, 1 119(1/2): 202-208.

[18] Li S, Tian M, Row K H. Effect of mobile phase additives on the resolution of four bioactive compounds by RP-HPLC [J].Int J Mol Sci, 2010, 11(5): 2 229-2 240.

[19] Tian M, Liu J, Row K.H. Effect of ionic liquids as the mobile phase additives on the HPLC resolution of four active compounds from Sophora Flavescens Ait [J].Molecules, 2009, 14(6): 2 127-2 134.

[20] Fernández-Navarro J J, García-álvarez-Coque M C, Ruiz-ángel M J. The role of the dual nature of ionic liquids in the reversed-phase liquid chromatographic separation of basic drugs [J].J Chromatogr A, 2011, 1 218(3): 398-407.

SimultaneousDeterminationofLiensinine,IsoliensinineandNeferineinNelumbinisPlumulabyReversedPhaseHighPerformanceLiquidChromatographyUsingIonicLiquidsastheMobilePhaseAdditives

WANG Hong-min1TANG Yan2SUN Ai-ling2LIU Ren-min1,2

(1.School of Pharmacy, Liaocheng University, Liaocheng 252059，China； 2.School of Chemistry and Chemical Engineering, Liaocheng University, Liaocheng 252059，China)

A reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) method for simultaneous determination of liensinine, isoliensinine and neferine inNelumbinisPlumulawas established by using 1-hexyl-3-methylimidazolium tertafluoroborate ([HMIM][BF4]) as the mobile phase additives. A SPHERIGEL ODS C18 column (250 mm×4.6 mm I.D., 5 μm was used for separation. Methanol/water (70/30, v/v) containing 30 mmol/L [HMIM][BF4] was used as the mobile phase. The pH of the mobile phase was 3.0 and the flow rate of the mobile phase was 1.0 mL/min. The detection wavelength was 280 nm. In the range of 2-200 μg/mL, the linear correlation coefficients were all better than 0.999 7. For liensinine, isoliensinine and neferine, the LOD of this method was 0.14, 0.17 and 0.19 mg/L, respectively, and the LOQ of this method was 0.29, 0.35 and 0.41 mg/L, respectively.

ionic liquids, mobile phase additives,NelumbinisPlumula, alkaloids, reversed phase high performance liquid chromatography

2017-05-09

国家自然科学基金资助课题(21675071)资助

柳仁民,E-mail:liurenmin@lcu.edu.cn.

O657.7+2

A

1672-6634(2017)03-0035-06