Pb2+对黑斑蛙早期生长发育影响的研究①

杜一帆 闫华超

(1.首都医科大学 基础医学院，北京 100069；2.聊城大学 生命科学学院，山东 聊城 252059)

Pb2+对黑斑蛙早期生长发育影响的研究①

杜一帆1闫华超2

(1.首都医科大学 基础医学院，北京 100069；2.聊城大学 生命科学学院，山东 聊城 252059)

研究了Pb2+质量浓度在10，20，30，40和50 mg/L时对黑斑蛙(Rananigromaculata)胚胎期及Pb2+质量浓度在0.07，0.30，1.00 mg/L时对黑斑蛙蝌蚪期生长发育的影响.结果表明，Pb2+对胚胎期的毒性于孵化期和开口期表现显著，其余各期毒性不如这两期明显. Pb2+能影响黑斑蛙胚胎期和蝌蚪期的生存率，对蝌蚪的生长发育具有明显的抑制作用(P<0.01)，但组间差异均不显著(P>0.05)；同时质量浓度为30，40，50 mg/L时会导致孵化期胚胎畸形，致畸率50 mg/L质量浓度水平最高(4.41%)，40 mg/L水平次之(3.33%)，30 mg/L水平最低(2.39%).各质量浓度水平均导致蝌蚪头部泡状膨大、“S”型尾和形体较小(为正常体长的0.50-0.67)等，致畸率1.00 mg/L质量浓度水平最高(2.25%)，0.30 mg/L水平次之(2.00%)，0.07 mg/L水平最低(0.50%).并对致毒原因进行了初步分析.

Pb2+，黑斑蛙，早期发育，胚胎期，蝌蚪期

目前中国由于在重金属的开采、加工、冶炼过程中，造成一些重金属如铅、汞、钴、镉等进入大气、水、土壤引起严重的环境污染.随着废水的排放，水域污染日益严重.其中铅是最常见的重金属之一，当铅离子浓度超过国家规定的农田水质标准时，就会对水生生物产生一定的毒害作用[1,2]，进而对位于食物链上层的哺乳动物造成毒害[3,4].国内外对重金属致淡水鱼类的毒害进行了大量研究[1-5]，而有关重金属对两栖类影响的报道不多[6,7]：李万江[8]做了重金属铅、汞对花背蟾蜍蝌蚪毒性作用的初步研究；Lefcort[2]等研究了重金属对青蛙生长发育的影响；蔡垚等[9]研究了重金属镉和铅对黑斑蛙肝脏过氧化氢酶活性的影响；阳增[10]研究了 Hg2+、Pb2+对牛蛙坐骨神经干动作电位阈值及传导速度的影响；贾秀英[11-13]等研究了镉、铅对黑斑蛙脏器组织的亚慢性毒性效应及对雄性黑斑蛙生殖毒性. 为此，本文选择了聊城市区黑斑蛙的受精卵为研究对象，用染毒法研究了Pb2+对黑斑蛙胚胎期及蝌蚪期生长发育的影响，以此探讨Pb2+影响两栖类生长发育的机制，为进一步探讨重金属污染对水生动物的毒害机理积累科学依据.

1 材料与方法

1.1 试剂

Pb(Ac)2为国产分析纯，取Pb(Ac)2用蒸馏水配成含Pb2+为100 mg/L的母液并滴入几滴冰乙酸以防止铅离子水解，再用蒸馏水连续稀释至实验浓度.

1.2 材料

实验材料采自徒骇河聊城区段，于4月底至5月中旬取河水中未发育的黑斑蛙卵块，放入清洁的容器内带回实验室镜检，剔除未受精的卵，将受精卵养在大鱼缸中.一部分直接供胚胎期毒性试验用，另一部分待其孵化至蝌蚪期，供蝌蚪期的毒性试验用.胚胎发育分期参照朱治平[14]的方法.

1.3 方法

1.3.1 Pb2+对胚胎期发育的影响.以国家农田水质标准[15]中的铅离子浓度为最低浓度，依次设计5个浓度梯度，各浓度水平依次为10，20，30，40，50 mg/L.先预实验，找出药剂作用的大致浓度范围(即出现死亡的浓度到全部死亡的最低浓度).然后分组实验，每组取受精卵30粒，置于高为2 cm、直径为12cm的培养皿中，分别放入上述各浓度梯度的溶液，设3个平行组，1个对照组，实验在培养箱内进行(水温23℃-26℃).按胚胎发育的各个时期进行连续观察，记录畸形数和死亡数，死亡的胚胎予以剔除，并统计其平均值，最后计算出各期畸形率(各期畸形率=各期畸形尾数/实验总尾数×100%)和各期死亡率(各期死亡率=各期死亡尾数/实验总尾数×100%).结果采用t检验(P<0.05差异显著，P<0.01差异极显著).

1.3.2 Pb2+对蝌蚪期发育的影响

(1) Pb2+对蝌蚪24、48 h的半致死浓度获得：先预试，找出24、48 h 半致死浓度范围(29-31 mg/L).设置9个浓度梯度(质量浓度水平依次为29.00，29.25，29.50，29.75，30.00，30.25，30.50，30.75 ，31.00 mg/L)设3个平行组.在高为9 cm、直径为20 cm的玻璃水槽中，放入供试浓度的药液500 mL.每个水槽中放入正常发育的蝌蚪30尾，试验开始后分别于24、48 h，检查其死亡率，统计并计算出LC50值.

(2) Pb2+对蝌蚪生长发育的影响：实验设计铅离子梯度浓度分别为0.07，0.30，1.00 mg/L的3个实验组和1个对照组，实验用水为蒸馏水，每个梯度浓度做2个平行，于每个水族玻璃缸中分别放入200尾进行观察.记录各缸畸形数和死亡数，统计畸形率.为保持培养液的清洁和浓度的稳定，每3天换一次染毒水，每5天用毫米方格纸测量一次蝌蚪的尾长、尾宽和头长，每缸每次随机测量10尾蝌蚪，取其平均值.畸形率=[各时期畸形尾数总和/400(每缸总尾数200×2个平行)]×100%.结果采用t检验，P<0.05差异显著，P<0.01差异极显著.

2 结果与分析

2.1 Pb2+对黑斑蛙50%出膜时间及孵化率的影响

图1 铅离子浓渡对黑斑蛙受卵的孵化影响

在黑斑蛙受精卵的孵化过程中随着Pb2+的浓度的增加，50%出膜时间明显缩短(表1，图1)，其原因估计是铅离子增加了黑斑蛙受精卵角质保护膜的通透性，从而使胚胎能从外界更快获得氧气而加快发育的速度，也可能是保护膜受损，使蝌蚪更容易出膜，所以表现为出膜时间缩短.从图1上我们还可以看出，铅离子达到一定浓度时，50%出膜时间从24.4 h迅速缩短为18.8 h，但随着铅离子浓度的梯度提高，50%出膜时间的趋近一固定值，这说明铅离子对受精卵角质膜的通透作用是有一个极限浓度的，当超过该浓度时，高出的浓度对50%出膜时间不再有明显影响.

表1 铅离子各浓度组50%出膜时间及孵化率

另外通过对实验数据的分析还发现，铅离子的浓度对孵化期的孵化率基本没有影响，主要原因是在孵化期以前，蝌蚪的孵化完全靠卵黄储备的营养，而铅离子的渗透在短时间内通过卵膜进入胚胎内的量极小，对胚胎发育不会产生明显影响(表1).

2.2 Pb2+对黑斑蛙胚胎发育的毒性影响

在胚胎发育的25个时期中，铅离子在有效浓度下(30-50 mg/L)对孵化期及开口期毒性影响较为明显，其余各期影响不显著，原因可能是孵化后胚胎失去了卵角质膜的保护，铅离子更易进入，致使胚胎内铅离子的沉积量增大，毒性增大，从而出现了死亡的第一个高峰期；又由于蝌蚪摄食活动的出现、呼吸活动的加强，使铅离子进入胚胎体内的机会进一步增多，使胚胎内铅离子的浓度增大，出现了死亡的第二个高峰期.其中第二个高峰期的死亡率略大于第一个高峰期，显然与铅离子随着机体生命活动的加强而进入体内的量增多有关.

黑斑蛙在自然环境中，畸形个体极少被发现，因而有关畸形现象的报道和研究资料也很少.除极少数未受精卵外，黑斑蛙胚胎都能发育到出水孔完成期.按国家农田水质标准，铅离子对黑斑蛙胚胎的毒性影响不明著.随着铅离子浓度的增大，死亡率逐渐升高.由实验所测得的铅离子有效作用浓度范围(表2)可知，铅离子对黑斑蛙胚胎的影响在高浓度下较显著.

表2 铅离子对黑斑蛙胚胎发育的影响

注：*P>0.05 差异不显著；**P<0.05 差异显著；***P<0.01 差异极显著(与对照组比较)

图2 铅离子浓度对黑斑蛙胚胎的影响

黑斑蛙孵化期的铅离子致毒畸形主要表现为腹部膨大(见图3、4)和泡状炎症(见图5、6)，主要原因可能是铅离子进入黑斑蛙胚胎内后影响了它们的正常生理活动从而导致内脏器官发炎，虽能存活一段时间，但其发育停滞于肌效期，最后腹部破裂死亡.开口期的致毒畸形主要表现为尾部侧弯及上翘(见图7、8)，分析原因可能是铅离子对黑斑蛙胚胎的神经系统产生毒害作用所致，但胚体能继续发育.可见铅离子对胚胎的畸形发生有一定的影响.

图3 畸形的蝌蚪(腹部膨大)与正常蝌蚪比较 图4 腹部膨大破裂的蝌蚪

图5 头部出现泡状炎症的蝌蚪 图6 腹部出现泡状炎症的蝌蚪

图7 尾部侧弯的蝌蚪 图8 尾部弯曲上翘的蝌蚪

2.3 Pb2+对蝌蚪期发育的影响

表3铅离子对蝌蚪24、48 h的半致死浓度

平均体长/cm平均体重/gLC50/mg/L24h48h10．550．01330．4530．18

2.3.1 Pb2+对蝌蚪24、48 h的半致死浓度.根据3个平行组中蝌蚪的死亡率，统计得出24、48 h 的LC50值(表3).通过分析LC50数据可以得出这样的结论：蝌蚪对铅离子的耐受性较强，只有在较高浓度下(30 mg/L)，铅离子对蝌蚪的死亡率才有明显的影响.

2.3.2 Pb2+对蝌蚪生长发育的影响

(1) 蝌蚪致畸现象的观察：黑斑蛙蝌蚪铅离子染毒畸形主要表现为头部和腹部出现泡状炎症，呈膨大透明状，在0.07，0.30和1.00 mg/L浓度水平畸形率分别为0.25%，0.75%和0.25%；个体生长缓慢(不及正常个体大小的60%)，尾巴呈“S”型的在0.07，0.30和1.00 mg/L浓度水平畸形率分别为0.25%，1.25%和2.00%.结果显示：1.00 mg/L质量浓度水平的畸形率最高，为2.25%；0.30 mg/L质量浓度水平次之，为2.00%；0.07 mg/L质量浓度水平最低，为0.50%.

(2) 铅离子对蝌蚪尾长、尾宽和头长的影响：分别于第5、15、25、35和45 d时，每缸中各测量8尾黑斑蛙蝌蚪，测量指标有尾长、尾宽和头长，取其平均值(表3).由于5 d前各浓度梯度组蝌蚪尾长和头长相差很小，故各浓度组的平均增长量以45 d时的长度减去第5 d时的长度来计算；而尾宽在第5 d时都在1 mm以内(难以测量)，其平均增长量以第45 d时的长度减去第15 d时的长度来计算.结果显示除0.07 mg/L组的尾宽增长量与对照组差异显著外，其余各项指标差异均极显著(表4).

表4 铅离子对蝌蚪尾长、尾宽和头长的影响

表5 铅离子对蝌蚪尾长、尾宽和头长平均增长量的影响

注：*P<0.05差异显著；**P<0.01差异极显著(与对照组比较)

3 讨论

3.1 Pb2+对黑斑蛙孵化期及开口期的毒性

从表1和表2可以看出：在胚胎发育的25个时期中，铅离子在有效浓度下(大于30 mg/L)对孵化期及开口期的蝌蚪毒性影响较显著，其余各期影响不明显.各实验组的死亡率都比对照组高，且随铅离子质量浓度的增大而升高.作者认为这是因为孵化后的胚胎失去了卵角质膜的保护，铅离子更易进入胚胎，致使胚胎内铅离子的沉积量增多，毒性增大，出现了死亡的第一个高峰期；随着摄食活动的出现、呼吸活动的加强，使铅离子进入胚胎体内的机会进一步增多，使胚胎内铅离子的浓度增大，出现了死亡的第二个高峰期.其中第二个高峰期的死亡率略大于第一个高峰期，显然与铅离子随着机体生命活动的加强而进入体内的量增多有关.

3.2 Pb2+对黑斑蛙蝌蚪期的毒性

从表2可以看出：黑斑蛙蝌蚪对铅离子的耐受性较强，只有在30 mg/L浓度以上时，铅离子对蝌蚪的死亡率才表现出明显的影响.作者认为这是因为随着蝌蚪的发育，蝌蚪各生理功能趋于完善和对污染环境的适应，表现出对逆境危害的调节能力增强.

蝌蚪畸形观察结果显示：0.07 mg/L质量浓度水平的畸形率最低(0.50%)；0.30 mg/L质量浓度水平的畸形率次之(2.00%)；1.00 mg/L质量浓度水平的畸形率最高(2.25%).这说明铅离子随着质量浓度的升高对蝌蚪致毒、致畸作用增强.

从黑斑蛙的尾长、尾宽及头长的发育来看，各梯度浓度铅离子对蝌蚪的生长发育均有抑制作用(与对照组相比差异显著，P<0.05)；但染毒组之间差异并不显著(P>0.05).说明当铅离子质量浓度继续升高时，由于铅对铅的拮抗作用，在一定质量浓度范围内其毒性作用将不会有明显差异.

总之，Pb2+对黑斑蛙的早期发育具有明显的影响.这种影响主要表现为能使处于孵化期和开口期的胚胎致死(致死率随浓度的升高而升高)以及影响蝌蚪的正常发育(发育缓慢及畸形).随着我国化工业的迅猛发展，化工业废料所造成的环境污染也愈来愈严重.某些废料中含有大量的铅离子，如果对这些废料不加处理直接排入水中，将会对包括黑斑蛙在内的所有水生生物产生影响.这不仅不利于渔业发展，并且铅离子通过生物链的级联放大作用逐级传递并逐渐累计，最终将会对最高级消费者——人，产生致命的危害.因此各级政府及环保部门应加大检查执法力度，防止农业用水中铅离子浓度超标，在保护环境的同时也保护了我们自己.

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StudingonToxicityofPb2+toEarlyDevelopmentofRanaNigromaculata

DU Yi-fan1YAN Hua-chao2

(1.School of Basic Medicine,Capital Medical University, Beijing 100069，China; 2.School of Life Science,Liaocheng University, Liaocheng 252059，China)

Study on toxicity of Pb2+(at 10,20,30,40 and 50 mg/L) to embryos ofRananigromaculata. and Pb2+at 0.07,0.30,1.00 mg/L to larvae ofrananigromaculatafor show to their growth influence. The result showed that the toxicity of Pb2+is higher to embryos during hatching and mouth open stages, while it is lower to other stages. In addition, therananigromaculataembryonic period and the tadpole time survival rate is effected by Pb2+, the embryo and tadpole’s growth is inhibitory action obviously (P<0.01), but group difference not remarkable (P>0.05); Simultaneously the mass concentration at 30,40,50 mg/L causes the hatching period embryo to be abnormal, the unbalanced rate at 50 mg/L mass concentration level is highest (4.41%),at 40 mg/L is lower(3.33%), at 30 mg/L is lowest (2.39%). Various mass concentration water causes the tadpole forehead to soak the shape equally to expand, “S” the tail and the physique is small (for normal body long 0.50-0.67) and so on, the unbalanced rate at 1.00 mg/L is highest (2.25%),0.30 mg/L is lower (2.00%), 0.07 mg/L is lowest (0.50%). Finally, the cause of toxice effect of Pb2+to early development is analyzed in the paper.

Pb2+,Rananigromaculata, early development, embryos stages, larvae stages.

2017-05-28

国家自然科学基金项目(31272383)；聊城大学校计划项目(318011504)资助

闫华超，E-mail:yanhuachao@lcu.edu.cn.

Q959.5; X503

A

1672-6634(2017)03-0041-06