非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变及其临床背景关系分析

王 巍，姜 江，荣 光，黄 宏， 张永胜， 石怡珍

(苏州大学附属第二医院 a.核医学科; b.病理科，江苏 苏州 215004)

·论著·

非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变及其临床背景关系分析

王 巍a，姜 江a，荣 光a，黄 宏a， 张永胜b， 石怡珍a

(苏州大学附属第二医院 a.核医学科; b.病理科，江苏 苏州 215004)

目的探讨非小细胞肺癌患者EGFR基因突变状况以及与各临床背景间的关系。方法采用扩增阻遏突变系统taqman-ARMS法对257例非小细胞肺癌患者肿瘤组织进行了EGFR基因检测，并回顾性分析突变情况与病理类型、TNM分期、患者性别、年龄及生活习惯等临床背景间的关联性。结果257例非小细胞肺癌样本中，EGFR突变率为38.5%，93例存在单一突变，6例存在两种突变，突变主要集中在19外显子缺失突变和21外显子的点突变。腺癌突变率明显高于鳞癌及其他非腺癌(P<0.01) 。女性突变率高于男性(P<0.01)。≤65岁与>65岁两组间差异无统计学意义(P>0.05)。非吸烟者突变率明显高于吸烟者(P<0.01)，突变与吸烟年限关联不明显，与日吸烟量明显相关(P<0.01)。根据TNM分期，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期各组间比较突变率差异无统计学意义。中、高分化间突变与低分化相比较差异有统计学意义(均P<0.01)。结论非小细胞肺癌EGFR基因突变与性别、组织学分型、肿瘤分化程度、吸烟以及日吸烟量等临床特征显著相关，与年龄、淋巴结转移、TNM分期及吸烟年限等无明显相关。

癌，非小细胞肺 ；受体，表皮生长因子； 突变

国际癌症研究机构(IARC) 于2013年12月12日公布，肺癌是世界范围内发病率和病死率最高的恶性肿瘤[1]。目前在中国，肺癌的发病率和病死率也均居恶性肿瘤之首[2]。而肺癌患者中约有80%～85%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)，且有近一半以上的 NSCLC确诊即为晚期[3]。近10年来，随着表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor， EGFR)这个靶点的发现和相关药物的发展，使NSCLC的治疗进入了基于分子靶点的个体化治疗时代 。本研究汇总了2014年1月至2016年6月在我科临床基因扩增室进行检测的所有组织标本的EGFR基因结果，分析EGFR突变情况与患者性别、年龄及生活习惯、病理类型、TNM分期等临床背景间的关系。

1 资料与方法

1.1病例选择 2014年1月至2016年6月苏州大学附属第二医院收治的NSCLC患者257例，男150例，女107例，年龄29～85岁，平均(63.4±10.1)岁。吸烟者106例，不吸烟者151例。组织标本来自外科手术切除、纤维支气管镜下活检、经皮穿刺活检，并经病理证实，腺癌194例，鳞癌52例， 腺鳞癌8例，其他组织类型3例。患者术前均未经放化疗。

1.2DNA提取 标本均选取连续石蜡切片5～10片，1片进行苏木精伊红(HE)染色，显微镜下镜检，以确定肿瘤细胞的存在，估测肿瘤细胞百分比并提示分布区域。试剂盒为QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen公司，德国)。严格按照说明书操作提取肿瘤组织DNA，使用 Q5000超微量紫外分光光度计(Quawell，美国)测量所提取DNA浓度，260/280在1.7～2.1之间。DNA 浓度均稀释至5～10 ng/μl待用。

1.3PCR扩增 扩增仪为Roche LightCycler®480Ⅱ(Roche公司，德国)。检测试剂盒为Taqman-ARMS Detection Kit for the Analysis of Human EGFR Gene Mutations(苏州为真生物医药科技有限公司，中国)。试剂盒采用8联管设计，最终反应体系为20 μl。反应程序：预变性95 ℃ 5分钟，(95 ℃ 20 s+ 63 ℃ 40 s)/循环，循环45次，40 ℃冷却10 s，结果按照说明书进行分析，判定。

1.4统计学方法 应用SAS9.4统计软件进行分析，组间分类变量比较采用χ2检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1EGFR基因突变检测结果 257例NSCLC中，检测到EGFR突变99例(38.5%)。其中单突变93例，包括19外显子缺失突变48例(48.5%)，21外显子点突变39例(39.4%)，20外显子突变6例(6.1%)，未检测到18外显子点突变；双突变6例，分别是E19-del和S768I 1例，E19-del和L858R 1例，E19-del和T790M 2例，L858R和T790M 2例。99例突变中，以19外显子746-752位密码子的缺失突变或21外显子L858R的点突变为主，共92例(92.3%)。见图1 。

2.2EGFR基因突变与性别、年龄及生活习惯的关系 本组病例中，≤65岁者153例，57例突变(37.3%)，>65岁者104例，42例突变(40.4%)，两者间差异无统计学意义(χ2=0.256，P>0.05)；男性150例，突变35例(23.3%)，女性107例，突变64例(59.8%)，女性突变率明显高于男性(χ2=33.727，P<0.01)。见表1。分析257例患者生活习惯，吸烟者106例，18例EGFR基因突变(17.0%)，非吸烟者151例，突变81例(53.6%)，差异具有统计学意义(χ2=35.346，P<0.01)(图2)。进一步对106例吸烟患者的吸烟史及日吸烟量进行了分组分析，吸烟史按照每10年分段共5组，组间差异均无统计学意义(P>0.05)。日吸烟量按照10支分期共分4组，各组间差异有统计学意义。尤其是每日吸烟量≤10支组与>10支组比较，差异有统计学意义(χ2=14.629，P<0.01)。同时，不难发现随着日吸烟量的增加，基因突变率逐渐下降。EGFR突变与吸烟年限关联不明显，但与日吸烟量明显相关。

表1 EGFR突变情况

图2 患者吸烟状况与EGFR基因突变关系

2.3EGFR基因突变与病理特征的关系 257例患者根据病理组织分型，腺癌194例，91例(46.9%)基因突变，鳞癌52例，5例(9.6%)突变，腺鳞癌8例，3例(37.5%)突变，其他组织类型3例，未发现突变。从突变率看，腺癌明显高于鳞癌以及其他非腺癌(P<0.01)。此外，根据病理特征分组，低分化者42例，4例(9.5%)突变，中分化者105例，47例(44.8%)突变，高分化者15例，8例(53.3%)突变。中、高分化间突变率差异无统计学意义(P>0.05)。但是，中、高分化间突变率明显高于低分化组(均P<0.01)。肿瘤分化情况不详者95例，40例突变(42.1%)。见表2。

回顾手术与影像学资料，257例患者按照淋巴结是否转移进行分组，淋巴结转移140例，54例突变(38.6%)，暂未发现淋巴结转移117例，45例突变(38.5%)(P>0.05)。TNM分期，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期EGFR基因突变率分别为47.8%、31.0%、32.5%、37.7%，各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 EGFR突变情况

注：与鳞癌比较， χ2=23.967，*P<0.01；与非腺癌比较，χ2=23.500，#P<0.01。 由于腺鳞癌病例少，未进行单独统计。与中分化比较， χ2=29.002，△P<0.01；与高分化比较，χ2=12.763，▲P<0.01

3 讨 论

EGFR是一种跨膜受体酪氨酸激酶，该酪氨酸激酶区域的激活即磷酸化对肿瘤细胞的增殖、生长、转化、血管生成以及凋亡等作用重大[4-6]。EGFR基因突变仅见于肿瘤组织，尤其是NSCLC，约有40%～80%上调表达EGFR。研究表明，发生在EGFR-TK结构域的突变共有486个，集中在18～21外显子。其中90%是外显子19的密码子746～750主要位点的缺失突变及第21外显子的密码子858由亮氨酸变为精氨酸(L858R)的点突变[6-7]。自从2004年发现肺癌 EGFR基因突变，具有EGFR基因突变的NSCLC患者使用EGFR-TKI制剂的疗效得到众多国内外研究的肯定[8]。研究表明EGFR基因突变是肿瘤生长重要的调控基因，是目前最有前途的特异性肿瘤靶向诊疗分子之一，同时，EGFR突变与患者的某些临床背景有着密切的关联[9]。

本研究回顾分析了NSCLC患者257例， EGFR基因突变多见于女性、腺癌、不吸烟者，与相关文献相符[9]。 突变主要集中在19外显子的缺失突变及21外显子L858R的错义突变，突变率92.3%，与相关文献报道的90%接近[6，9]。257例中有99例(38.5%)不同程度发生突变，略低于报道的亚裔突变率(39%～64%)，这可能与样本量及样本的选择有关。这些具有基因突变的患者目前大部分都已经或者即将在靶向治疗中获益。本研究中具备女性、腺癌、非吸烟者的突变优势人群中，突变频率可达60%，与相关研究的突变率63%接近。在99例突变的样本中，有6例检出外显子20突变，其中4例是在19外显子缺失突变或L858R等敏感性突变的基础上合并790位密码子苏氨酸向蛋氨酸的突变(T790M)；6例中有1例为使用EGFR-TKI治疗中发生的耐药突变，其余5例均为治疗前的原始肿瘤组织标本。有研究表明T790M不仅仅存在于已经接受EGFR-TKI治疗患者中，即与获得性耐药有关，还可能与致癌有关[10-12]。Cross及Yun等[13-14]认为EGFR基因由于存在T790M突变，导致侧链空间结构增大，出现位阻现象(steric hindrance)，阻碍了EGFR-TKI与酪氨酸激酶的结合；另一方面T790M突变使EGFR与ATP亲和力增加，导致EGFR-TKI无法有效阻断信号通路而导致耐药。第三代靶向药物能够不可逆的与EGFR激酶ATP结合位点的第797位氨基酸半胱氨酸结合，抑制EGFR激酶磷酸化及下游肿瘤信号通路的激活，因此能够抑制EGFR敏感突变及T790M突变的肿瘤细胞，为获得性耐药T790M阳性患者增加了治疗的机会，因此，目前建立多种检测平台如数字PCR、二代测序等方法提高T790M突变检测的敏感度是后续努力的方向。

在众多临床背景中，与EGFR突变独立相关的是组织类型与吸烟状况[15]。本研究腺癌患者突变率高达46.9%，明显高于非腺癌。在吸烟方面，由于257例患者中女性基本为不吸烟者，因此单独将男性患者进行分类比较。发现男性患者吸烟与不吸烟基因突变的差异有统计学意义(χ2=9.982，P<0.01)。在各个外显子的突变上，非吸烟者都明显高于吸烟者。同时发现相对吸烟年限，吸烟者的日吸烟量与EGFR的基因突变关联更大，在本研究中，日吸烟超过30支的患者22例，无1例存在EGFR突变，可见，日吸烟量越大，基因突变可能就越小，这与文献[16]观点一致。由于患者的生活习惯都是来自患者或家属的自述，吸烟年限、每日吸烟支数无法保证特别精准，所以研究结果可能会存在一定的偏差。

另外，从患者的病程以及病理学特征分析，本研究中EGFR基因突变与TNM分期无明显关联，与肿瘤分化程度有一定相关性，肿瘤分化越好，突变率越高。这虽然与有些文献观点相符[17-18]，但同时又与另外一些报道相反[19]。出现两种相反的观点，最大原因应该是标本量的局限，以及组间样本量的差异过大。本研究中，高分化患者仅有15例，有95例无法获得其具体的分化情况，这些都会影响最终的统计分析结果。

因此，需要加大样本量，详实病史资料，以便更清楚地了解靶点基因EGFR与NSCLC的关系，同时也希望通过相关临床背景的统计分析，认识其与基因突变的相互关联，一方面，有助于临床确定最佳用药人群，优化符合患者临床特征的个性化诊治方案，在NSCLC靶向治疗中更有针对性；另一方面，可提醒人们选择良好的生活习惯，使健康生活更有保证。

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Epidermalgrowthfactorreceptormutationsinnon-smallcelllungcancerandclinicalbackground

Wang Weia， Jiang Jianga， Rong Guanga， Huang Honga， Zhang Yongshengb， Shi Yizhena

a.DepartmentofNuclearMedicine;b.DepartmentofPathology，theSecondAffiliatedHospitalofSoochowUniversity，Suzhou215004，China

ShiYizheng，Email:szdrshi88@163.com

ObjectiveTo investigate the relationship between epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations and different clinical backgrounds in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC).MethodsEGFR mutations in the tumor tissues of 257 NSCLC patients were analyzed by TaqMan-ARMS (TaqMan-amplification refractory mutation system). The mutation of EGFR was explored in correlation with the clinicopathological features， TNM stage， gender， age and habits of patients.Results99(38.5%) EGFR mutations， which were mainly located in exon 19 with the pattern of deletion mutation and exon 21 with the point mutation， were identified among 257 NSCLC patients. The mutation rate was higher in patients with adenocarcinoma and adenosquamous carcinoma than that in patients with squamous cell carcinomas and other subtypes(allP<0.01). Mutation rate in female was higher than that in male(P<0.01). However， no evident association was found between EGFR mutation and age(P>0.05). EGFR gene mutations occurred more frequently in non-smokers compared with smokers (P<0.01). EGFR mutation was not associated with smoking years， but significantly correlated with daily smoking (P<0.01). There was no significant difference between EGFR gene mutation and clinical TNM stage of NSCLC(Ⅰ，Ⅱ， Ⅲ and Ⅳ). EGFR mutation rates in patients with different pathological characteristics， to some extent， were different. Mutation was significantly different between low differentiation and middle or high differentiation (P<0.01).ConclusionEGFR gene mutation in NSCLC was significantly correlated with gender， histological type， tumor differentiation， smoking and daily smoking amount but not with age， lymph node metastasis， TNM stages and smoking years.

carcinoma，non-small cell lung；receptor，epidermal growth factor； mutation

石怡珍，Email: szdrshi88@163.com

R743.2

A

1004-583X(2017)11-0957-04

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.11.010

2017-07-19 编辑:武峪峰