晚期非小细胞肺癌中c-MET、ALK、ROS1基因突变的相关性及临床意义

朱卫东，石晨曦，李三恩，郭凌川

晚期非小细胞肺癌中c-MET、ALK、ROS1基因突变的相关性及临床意义

朱卫东，石晨曦，李三恩，郭凌川

目的探讨晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中发生c-MET扩增、ALK和ROS1基因重排的阳性率、基因变异，及其与临床病理特征的相关性。方法采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)检测91例晚期NSCLC中c-MET、ALK、ROS1基因，分析发生c-MET扩增、ALK/ROS1基因重排的阳性率及其相互间发生变异的相关性。结果NSCLC患者c-MET基因的阳性率为8.79%(8/91)，女性c-MET扩增率显著高于男性(19.4%vs1.82%，P=0.006)；≥60岁患者c-MET扩增阳性率高于<60岁(8.89%vs7.5%)；Ⅲ期患者阳性率高于Ⅳ期患者(9.62%vs7.69%)；腺癌患者c-MET扩增阳性率为9.2%，鳞癌患者中未发现c-MET扩增。NSCLC中ALK和ROS1融合的阳性率分别为10%和13.3%，且发现1例患者同时存在c-MET扩增和ROS1基因重排。结论NSCLC中c-MET基因扩增阳性率与患者性别相关，女性患者发生率明显高于男性，而与患者年龄、病理类型和临床分期相关性不明显。c-MET基因扩增与ALK/ROS1基因重排的发生几乎无共存，但并非完全排斥；该实验首次发现1例患者同时存在c-MET扩增和ROS1基因重排。

肺肿瘤；非小细胞肺癌；c-MET扩增；病理特征；ALK融合；ROS1融合

肺癌在中国的发病率和病死率最高[1]，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌患者发病数的80%～85%。NSCLC驱动基因的靶向药物因其靶点明确、疗效好、副作用小，改变以往的肺癌治疗模式，如针对EGFR的酪氨酸激酶抑制剂类药物(易瑞沙、特罗凯、凯美纳、阿法替尼)和针对ALK的抑制剂药物(克唑替尼、色瑞替尼)，均有效改善NSCLC患者的生存期和生存质量[2-3]。c-MET原癌基因又称肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)受体，与EGFR基因一样位于7号染色体(7q21-31)。c-MET基因发生异常，如c-MET基因扩增、突变、过表达等，均可导致HGF/MET通路的异常激活，参与肿瘤的发生、侵袭和转移[4]。由于c-MET基因在肿瘤生物学的重要作用，已成为NSCLC靶向治疗的新热点，大量临床试验正在研究如何抑制MET代谢通路来治疗肿瘤。研究发现，除EGFR T790M突变外，c-MET基因扩增也是导致NSCLC患者对EGFR-TKI药物获得性耐药的机制之一[5]。同时，发生c-MET基因扩增的NSCLC患者，与发生ALK融合和ROS1融合的NSCLC患者服用克唑替尼药物均有显著疗效。本实验通过荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)法检测NSCLC患者的c-MET基因扩增，分析其与临床病理特征的相关性，同时通过FISH法检测ALK和ROS1基因融合，探讨NSCLC患者中ALK融合基因和ROS1融合基因与c-MET扩增的相关性。

1 材料与方法

1.1临床资料收集2015年9月～2016年6月苏州大学附属第一医院保存的91例肺癌组织标本。所有患者均由病理科确诊为NSCLC，且临床诊断分期为Ⅲ、IV期，其中石蜡包埋组织91例；男性55例，女性36例；年龄35～89岁，中位年龄60岁，<60岁40例，≥60岁45例；6例患者年龄不详；病理类型：腺癌87 例，鳞癌4例。

1.2方法

1.2.1c-MET基因扩增检测 应用FISH法检测MET基因的拷贝数。组织标本的MET扩增检测使用Vysis MET SpectrumRed FISH Probe和CEP7 (D7Z1) FISH Probe(Abbott Molecular Inc)。石蜡切片脱蜡采用环保型脱蜡液，脱蜡30 min(10 min，3次)后浸入100%乙醇脱水1 min，2次；胃蛋白酶消化处理(25 mg/40 mL)；70%、85%和100%乙醇梯度脱水，取10 μL探针滴加在载玻片上，盖上盖玻片，封片胶密封；置于Thermobrite原位杂交仪(Abbot)75 ℃变性5 min，37 ℃杂交过夜；然后将切片置洗涤液Ⅰ，轻轻振荡，使盖玻片与载玻片分离；立即将载玻片浸入72 ℃洗涤缓冲液Ⅱ中，2 min；室温暗处干燥加10 μL DAPI(1 000 ng/mL)染色，封固；-20 ℃放置至少30 min；荧光显微镜(Olympus BX43)下观察结果。

1.2.2FISH法检测ALK和ROS1融合 91例NSCLC中随机选取30例肺腺癌标本，采用FISH法分别检测ALK、ROS1基因融合。ALK融合的FISH检测使用Vysis LSI ALK双色分离探针(Abbott Molecular Inc)，该探针在ALK基因断点的3’端300 kb的片段标记为橙色信号，5’端442 kb的片段标记为绿色信号。ROS1融合的FISH检测使用Vysis 6q22 ROS1双色分离探针(Abbott Molecular Inc)，该探针在ROS1基因断点的3’端557 kb的片段标记为绿色信号，5’端317 kb的片段标记为橙红色信号。具体操作步骤按试剂盒说明书进行，荧光显微镜下观察结果。

1.3结果判断

1.3.1c-MET基因扩增判断 计数100个肿瘤细胞中MET信号和CEP7信号的数量，若MET/CEP7比值≥2.0，则为阳性；若MET/CEP7比值<2.0且平均MET拷贝数≥5.0，则为阳性；若MET/CEP7比值<2.0且平均MET拷贝数<5.0，则为阴性。

1.3.2ALK与ROS1融合判断 正常细胞核中，ALK双色分离断裂探针杂交后，会产生2个橙色和绿色融合信号；当存在ALK断裂易位时，杂交后的信号会产生1个橙色信号和1个绿色分离信号。在100倍油镜下采集图像。ALK融合阳性的结果判断标准：计数50个肿瘤细胞，阳性细胞≥50%为阳性，<10%为阴性；若阳性细胞≥10%且<50%，则需要重新计数50个肿瘤细胞，统计这100个肿瘤细胞，阳性细胞≥15%为阳性，<15%为阴性。ROS1的判读标准：计数100个肿瘤细胞，观察橙绿分离信号，阳性细胞≥15%为阳性；<15%为阴性

1.4统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计学处理，计数资料用χ2检验或Fisher确切概率法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1c-MET基因扩增与NSCLC临床病理特征的关系91例NSCLC患者中，有8例c-MET基因扩增(图1)，阳性率为8.79%。55例男性NSCLC患者中，仅1例c-MET扩增，阳性率为1.82%；36例女性患者中，有7例c-MET扩增，阳性率为19.4%。<60岁的NSCLC患者c-MET扩增阳性率为7.5%(3/40)，≥60岁的NSCLC患者c-MET扩增阳性率为8.89%(4/45)；腺癌组织中c-MET扩增阳性率为9.2%(8/87)，鳞癌组织中无c-MET扩增；Ⅲ期NSCLC患者c-MET扩增阳性率为9.62%(5/52)，Ⅳ期NSCLC患者c-MET扩增阳性率为7.69%(3/39)。由于阳性例数少，用Fisher确切概率法检测其余临床病理资料的相关性，Cappuzzo标准的扩增阳性与患者性别相关(P=0.006)，女性患者c-MET扩增阳性率明显高于男性；c-MET扩增与其他病理资料无显著相关(表1)。

表1 c-MET扩增与NSCLC临床病理特征的关系

2.2ALK、ROS1融合与NSCLC临床病理特征的相关性从91例NSCLC中随机选取30例肺腺癌标本，其中男性17例，女性13例；<60岁者8例，≥60岁者22例；有4例为c-MET扩增阳性。应用FISH法检测30例肺腺癌标本的基因。结果显示：ALK融合阳性为10%(3/30)(图2)，ROS1融合阳性率13.3%(4/30)(图3)。ALK融合在女性、<60岁和Ⅲ期NSCLC患者的阳性率高于男性。ROS1融合在女性NSCLC患者的阳性率高于男性，但差异无统计学意义；ROS1融合在≥60岁的NSCLC患者中阳性率明显高于<60岁的患者，Ⅳ期阳性率高于Ⅲ期(表2)。

①②③图1 c⁃MET基因扩增，红色为c⁃MET基因信号，绿色为CEP7信号，FISH法图2 ALK阳性细胞，见橙绿信号分离，FISH法图3 ROS1阳性细胞，见橙绿信号分离，FISH法

表2 ALK、ROS1融合与NSCLC临床病理特征的相关性

2.3c-MET基因与ALK、ROS1融合的相关性分析c-MET扩增与ALK、ROS1融合共存的病例较少，但并非完全排斥。本实验发现，有1例患者同时存在ROS1融合和c-MET扩增阳性(表3)。

表3 c-MET基因与ALK、ROS1融合的相关性

3 讨论

多项研究表明，由于实验者采用检测方法和判断标准的不同，EGFR野生型的NSCLC患者c-MET扩增率为2.4%～21%，在EGFR-TKI耐药患者中可达15%～22%[6]。本组91例NSCLC中，c-MET的扩增阳性率为8.79%，符合既往研究结果。由于本组患者是否对EGFR-TKI药物产生耐药的临床资料尚不清楚，因此数据未显示TKI耐药NSCLC患者与非选择NSCLC患者的c-MET扩增差异。此外，王杰等[7]认为c-MET的扩增与NSCLC患者性别、年龄、吸烟状态、肿瘤组织类型和临床分期无相关性。本实验通过Fisher确切概率法检验，首次发现c-MET扩增与患者性别相关，女性NSCLC患者的c-MET扩增阳性率明显高于男性。分析其原因，可能是本组NSCLC患者例数较少，尤其是女性患者只有36例，过少的例数可能导致结果的偏移。

克唑替尼是一种口服的TKI，对应肺癌驱动基因：ALK重排(3%～5%)、ROS1重排(1%～2%)和MET扩增多个靶点。在NSCLC中，ALK重排的克唑替尼在晚期NSCLC患者的治疗有显著疗效，2011年已被美国食品药品管理局(FDA)批准用于ALK阳性的转移性NSCLC治疗。2016年FDA又批准克唑替尼用于ROS1阳性的转移性NSCLC治疗。临床试验显示ROS1阳性进展期NSCLC患者服用克唑替尼，客观缓解率可达72%，中位无进展生存期达19.2个月。但它在c-MET阳性的晚期NSCLC中的作用依然处于探索阶段。有研究报道：在ALK重排阴性、MET扩增阳性的NSCLC患者口服克唑替尼后，出现良好的临床表现。本实验ALK融合的阳性率为10%，在年轻、女性患者中的阳性率较高，与之前报道一致[8]。ROS1融合的阳性率为13.3%，女性NSCLC阳性率高于男性，跟文献报道一致；与患者年龄显著相关，≥60岁的NSCLC患者中阳性率明显高于<60岁患者，而大多数研究报道显示ROS1重排更易发生于年轻患者[9-10]，但也有报道ROS1重排在年纪大的患者中更容易出现，如潘放等[11]发现ROS1重排在男性、>59岁的NSCLC患者中高发。多项数据显示ALK融合和ROS1融合的阳性率分别为3%～5%和1%～2%，造成不同差异的原因与人种、研究人群的选择及不同的检测方法有关。总之，约33.3%(10/30)的NSCLC患者存在上述3种基因的异常状态，且各基因间几乎不同时出现，与相关报道一致。然而也存在ROS1融合和c-MET 扩增共存的病例，意味着约33.3%的NSCLC患者可以使用靶向药克唑替尼进行治疗。

综上所述，c-MET基因扩增在NSCLC疾病的发生和进展中发挥重要作用，c-MET基因扩增应作为常规的基因检测项目，尤其在女性患者c-MET扩增率高的人群，可考虑c-MET、ALK和ROS1为靶点的分子病理联合检测，增加NSCLC患者个体化用药的机会。

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Analysisofc-MET,ALK,ROS1variantsinnon-smallcelllungcanceranditsclinicalsignificance

ZHU Wei-dong, SHI Chen-xi, LI San-en, GUO Ling-chuan

(DepartmentofPathology,theFirstAffilirtedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215000,China)

PurposeThe aim was to examine c-MET, ALK, ROS1 variants in advanced non-small cell lung cancer (NSCLC) patients, and to analysis the association of c-MET, ALK, ROS1 variants with the clinical and pathological features.MethodsThe c-MET, ALK, ROS1 were detected by fluorescence in situ hybridization (FISH) in the 91 cases of NSCLC specimens. The correlation of c-MET gene amplification with clinicopathological features and the ALK, ROS1 fusions was analyzed.ResultsThe positive rate of c-MET gene amplification was 8.79% (8/91) , the positive rates on male and female were 1.82% and 19.4%, respectively. In <60-years-old and≥60-years-old NSCLC patients, the positive rates were 7.5% and 8.89%, resepectively. The positive rate was higher in stage Ⅲ than stage IV (9.62%vs7.69%), the c-MET gene amplification was detected in 9.2% adenocarcinoma patients but none in squamous carcinoma patients. The detection rates of ALK fusions and ROS1 fusions were 10% and 13.3%, respectively. One patient was detected the coexistence of MET with ROS1 fusion.ConclusionThe c-MET gene amplification is correlated with gender, but not with age, histological types and clinical stages. C-MET amplification, ALK fusions and ROS1 fusions are almost no coexistence, but not completely mutually exclusive. To they knowledge, this is the first case report the coexistence of MET amplification with ROS1 fusion in NSCLC.

lung neoplasm; non-small cell lung cancer; c-MET gene amplification; clinicopathologic features; ALK fusions; ROS1 fusions

时间：2017-9-18 6:23 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170918.0623.012.html

接受日期：2017-06-20

苏州大学附属第一医院病理科，苏州 215000

朱卫东，男，主管技师。E-mail: 16586088@qq.com

R 734.2

A

1001-7399(2017)09-0997-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.09.012