一种新型快速组织处理技术在病理标本处理中的应用

2017-11-20马晓龙李红威刘从容

临床与实验病理学杂志 2017年9期

马晓龙，李红威，刘从容，王华

马晓龙1，李红威2，刘从容1，王华1

新型；快速组织处理；病理标本

目前，国内大部分医院病理科仍采用传统方法处理常规病理标本，整个过程耗时8～14 h，基本能满足日常病理诊断的需要[1-2]。随着现代医院规模不断扩大、病理科标本量增多、病床周转率逐渐增高的现象日趋凸显，病理诊断报告发放速度需随之加快，这就需要缩短标本处理时间[3-4]。因此，有些快速组织处理方法也逐渐被多家病理科应用到常规工作中。本科室在实践工作摸索出一种新型快速全自动组织脱水机联合使用Fast Flex快速组织处理试剂的方法，可在2～4 h内通过4个步骤自动完成病理标本的处理。为全面评估这种新型快速组织处理技术的效果，同时采用新型快速组织处理方法和传统组织处理方法，对不同类型组织在形态学、免疫组化及基因检测等方面进行比较，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料收集北京大学第三医院2013～2014年手术切除的病理标本45例，包括皮肤、扁桃体、甲状腺、乳腺、肺、胃、结肠、肝脏、前列腺、输卵管、子宫及尸检脑组织，采用传统常规组织处理方法完成整个流程，留取存档冷冻组织库中部分组织、采用快速处理程序进行处理。

1.2仪器(1)Tissue-Tek VIP6组织脱水机(Sakura)；(2)STP420ES新型自动组织脱水机(Thermo)；(3)全自动HE染色机(Leica ST5010)；(4)全自动免疫组化染色机(Benchmark XT，罗氏)；(5)Nanodrop DNA定量测定仪(Thermo)；(6)Real time-PCR仪(Qiagen，Agilent)。

1.3方法

1.3.1组织处理大标本取材大小为2.0 cm×1.5 cm×0.2/0.3 cm[5]，合计33例。模拟穿刺组织(长1 cm，直径约0.16 cm)及小活检标本(直径0.2～0.4 cm)合计12例。常规组标本采用10%中性福尔马林固定6～24 h，快速组标本用Fast Flex Holding Solution固定2 h，分别在不同脱水机中使用常规试剂和Fast Flex快速组织试剂处理标本，其中快速组标本在不同温度条件下依次通过3种快速脱水试剂及快速石蜡制剂，大标本处理时间为162 min，小标本处理时间为120 min。最后采用Leica石蜡包埋组织，4 μm厚切片，分别行HE染色及免疫组化染色。

1.3.2免疫组化选择18种常用一抗，阳性着色部位包括细胞膜、细胞质和细胞核。其中，HER-2、E-cadherin、CD20、CD38、CD3、CD117、CD99均为细胞膜着色；CK(AE1/AE3)、CK5/6、CK7、CK20、CK34βE12、CD68、SMA均为细胞质着色；ER、Ki-67、TTF-1、CDX-2均为细胞核着色。抗体分别购自DAKO、Leica及北京中杉金桥公司。除HER-2染色采用免疫组化自动染色机，其余均采用EnVision两步法进行手工染色。阳性对照选用相应一抗阳性组织切片，TBS替代一抗作为空白对照。

1.4结果判断

1.4.1HE染色评判标准 (1)按着色强度评判标准：深染为3分、中等染色为2分、浅染色为1分；(2)按细胞核、细胞质及细胞膜着色对比度评判标准：清晰为3分、部分清晰为2分、不清晰为1分；(3)按组织结构完整性评判标准：完整为3分、部分完整为2分、不完整为1分；(4)按细胞结构完整性评判标准：完整为3分、部分完整为2分、不完整为1分。4项得分相加为HE染色效果总分，满分为12分[6]。

1.4.2免疫组化染色评判标准免疫组化染色结果由两位病理医师进行评判；阳性信号为着色部位出现黄色或棕褐色颗粒。(1)按阳性信号定位的准确性判断： 90%～100%阳性信号定位准确为3分、50%～89%信号定位准确为2分、<50%信号定位准确为1分；(2)按阳性信号强度判断：棕褐色为3分、棕黄色为2分、淡黄色为1分、无着色为0分；(3)按阳性细胞比例判断：>50%为3分、10%～50%为2分、<10%为1分、无阳性细胞为0分；三项相加作为该切片评分值，其中HER-2判读标准参照《乳腺癌 HER-2检测指南(2014版)》[7]。

1.5石蜡包埋组织DNA提取、荧光Realtime-PCR法检测基因突变45例组织标本中选取病理诊断为非小细胞肺癌1例及结肠癌2例，10 μm厚石蜡切片5～10片，采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(QIAGEN)试剂盒、按试剂盒说明书提取DNA。采用Nanodrop 1000定量测定仪测定样本DNA纯度和浓度。采用QIAGEN公司的EGFR RGQ PCR检测试剂盒，检测非小细胞肺癌EGFR基因18、19、20及21外显子中的29种突变。采用艾德公司ADx-ARMS-Kras检测试剂盒检测结肠癌KRAS基因突变。每批反应均同时设阴阳性对照。反应结束后，通过荧光信号曲线及阈值线判读检测结果。

2 结果

2.1HE染色大组织：常规组HE染色各项得分均为3分，总平均分为12分；快速组总平均分为11.93分，其中HE染色强度平均3分、细胞核质对比度平均3分、组织结构完整性平均3分、细胞结构完整性平均2.93分；快速组中少数标本(3/45)的细胞膜结构稍欠清晰，但不影响病理组织学诊断。穿刺及小组织：快速组与常规组平均分均为12分。快速组处理的组织无论大小，其各项指标与常规组相比均无明显差异(图1、2)。

2.2免疫组化染色18种免疫组化抗体分别用于相应组织染色中，部分组织分别使用1～5种抗体，快速组和常规组各配套着染96张切片。快速组中各项免疫组化指标染色阳性定位准确，背景清晰，与常规组相比，两组得分具有明显正相关，其阳性着色部位、阳性强度及阳性细胞比例均无明显差别(图3～6)。

2.3基因突变检测常规组和快速组中均检测到一致性的基因突变，即1例肺癌标本中检测到EGFR基因Exon-19缺失突变、Exon-20 T790M点突变(图7)，2例肠癌标本中分别检测到KRAS基因第2外显子Codon-12中Gly12Val突变和Gly12Ala突变。

3 讨论

组织脱水机的容量和速度是加快大量病理标本处理的关键。新型STP420ES自动组织脱水机的容量较大，并且根据组织大小不同，设有主缸和副缸，主缸有360个包埋盒，主要用于大标本处理，副缸有60个包埋盒，可处理小活检及穿刺标本；主、副缸程序可同时或单独运行。由于大、小标本分开处理，使脱水机的运行效率在保证各种组织充分脱水的同时得到明显提高。更具特色的是，主反应缸的运行方式为滚筒式搅拌，可促进新鲜液体在组织周围流动，通过旋转方式定时交换化学试剂，使试剂与组织交换面积及效率较常规流程明显提高，有效缩短标本的处理时间[8]。此外，该设备同时使用Fast Flex快速反应试剂，进一步加快脱水速度，整个标本处理时间由常规的8～12 h减少到2～4 h，使制片时间及后续病理报告发放周期明显缩短，为需要进行特殊治疗如靶向治疗的患者赢得宝贵的治疗时间。

本组采用快速组织处理技术制备的小活检组织及穿刺组织，其HE染色效果较好，组织及细胞结构清晰，与常规组处理的效果无明显差异。在小标本的取材方面，为了达到与实际工作相符合的效果，首次采用模拟穿刺组织和小活检标本取材方法，这在以往研究中未见报道。多数大组织的切片染色效果与常规组无明显差异，但少数大组织在细胞膜结构完整性上略有差异，可能与试剂在短时间内对于大标本的固定和穿透性欠佳有关，这些组织通过适当改进HE染色[9]，可以达到与常规组类似的效果。因此，在使用这套设备及试剂时，需根据组织类别、大小，适当调整染色细节，以确保组织处理的效果和质量；并应该严格界定标本的取材厚度不超过3 mm，这也是保证标本处理效果的前提。

①②③④⑤⑥

图1常规组肝脏组织HE染色图2快速组肝脏组织HE染色图3常规组乳腺导管内癌中E-Cadherin呈阳性，EnVision两步法

图4快速组乳腺导管内癌中E-Cadherin呈阳性，EnVision两步法图5常规组乳腺导管内癌中ER呈阳性，EnVision两步法图6快速组乳腺导管内癌中ER呈阳性，EnVision两步法

图7 EGFR基因检测：EGFR基因Exon-19缺失突变、Exon-20 T790M点突变

在免疫组化染色效果的评定方面，本组实验选用病理外检工作中常用的抗体，这些抗体着染部位包括细胞膜、细胞质及细胞核。实验发现快速组处理的组织无论从着色部位、着色强度及阳性细胞比例上，与常规组均无明显差异，提示快速组织处理技术亦能够较好地保存细胞内的相关抗原。在基因突变检测方面，快速组能够检测到与常规组一致的基因突变，提示快速组织处理技术能够较好地保存细胞内的核酸。

综上所述，本组实验从形态学、免疫组化染色及基因检测对新型快速组织处理技术处理的组织进行较全面的评估，结果显示该项技术在组织处理速度和效率方面有一定的优势，且不影响抗原表达和核酸分析；但需要指出的是，本实验仅用少量标本进行测试，考虑到同样试剂容量处理标本时，小样本量的处理效果可能要优于大样本量。目前，该项快速组织处理技术的效果尚需进一步实践证明。

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[7] 《乳腺癌HER-2检测指南》编写组. 乳腺癌HER-2检测指南[J]. 中华病理学杂志, 2014,43(4):262-267.

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时间：2017-9-18 6:23 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170918.0623.028.html

R 361

1001-7399(2017)09-1046-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.09.028

接受日期：2017-07-09

1北京大学医学部病理学系/北京大学第三医院病理科，北京 100191