食管鳞状细胞癌中HIF-1α、CTSD表达和血管生成拟态的关系及其临床意义

周芳芳，卢林明，陈 冰

食管鳞状细胞癌中HIF-1α、CTSD表达和血管生成拟态的关系及其临床意义

周芳芳，卢林明，陈 冰

目的观察食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)组织中缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)、组织蛋白酶D(cathepsin D, CTSD)的表达情况，分析两者表达与血管生成拟态(vasculogenic mimicry, VM)及ESCC临床病理特征的关系。方法收集120例ESCC组织，采用CD34/PAS套染检测ESCC VM情况；免疫组化EnVision两步法检测ESCC中VM标志性分子血管内皮钙黏素(vascular endothelial cadherin, VE-cadherin)和血管内皮生长因子(vascular endothelial grow factor, VEGF)以及HIF-1α、CTSD的表达，分析HIF-1α和CTSD与ESCC临床病理特征的关系及各指标之间相关性。结果120例ESCC中HIF-1α和CTSD的表达与患者年龄、性别无关；与淋巴结转移、脉管癌栓形成、临床分期、病理分级等有关；120例ESCC中有25例存在VM；HIF-1α和CTSD在有VM组阳性率明显高于无VM组，且均与VM表达呈正相关；CTSD在HIF-1α阳性组的表达明显高于HIF-1α阴性组，且两者表达呈正相关；VE-cadherin、VEGF在CTSD阳性组的表达率明显高于CTSD阴性组，且与CTSD表达均呈正相关，提示在ESCC中CTSD表达与VM的形成相关。结论CTSD有可能通过HIF-1α参与ESCC中VM形成过程，另外HIF-1α和CTSD高表达提示ESCC患者预后不良。

食管肿瘤；鳞状细胞癌；缺氧诱导因子-1α；组织蛋白酶D；血管生成拟态

近年食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)病死率一直居高不下，多与其复发和转移相关。肿瘤的血管生成可以为肿瘤提供营养，促进其复发和转移。血管生成拟态(vasculogenic mimicry, VM)是一种不同于传统内皮细胞源性的肿瘤新生血管，多种因子均参与VM形成，如缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)[1-2]、迁移诱导蛋白7(migration inducing-protein 7, MIP7)[3]、血管内皮钙黏素(vascular endothelial cadherin, VE-cadherin)[4]和血管内皮生长因子(vascular endothelial grow factor, VEGF)[5]。但任何一种因子均不能解释VM发病机制，VM形成过程是否还涉及其他因子，有待于进一步分析 。组织蛋白酶D(cathepsin D, CTSD)属于天门冬氨酸水解酶，具有降解细胞外基质和基膜功能，研究表明其[6-7]在肿瘤的发生、发展中发挥一定作用。目前，关于CTSD与ESCC中VM之间关系报道较少，本文拟通过免疫组化EnVision两步法检测ESCC中HIF-1α、CTSD、VE-cadherin和VEGF表达，并结合临床病理特征，分析各项指标之间相关性，探讨CTSD是否参与ESCC VM形成，旨在为ESCC临床诊断、抗血管治疗及患者预后判断提供新思路。

接受日期：2017-07-14

1 材料与方法

1.1临床资料收集2012年6月～2014年6月皖南医学院附属弋矶山医院ESCC手术切除标本120例，其中男性96例，占80%；女性者24例，占20%；年龄42～77岁；所有患者术前均行活检，无家族史，术后经由3位长期从事病理诊断的高年资医师确诊为ESCC，手术前均无放、化疗史。根据肿瘤的分化程度组织学分级：高分化31例，中分化70例，低分化19例；根据肿瘤浸润食管壁深度：浸润至黏膜层及浅肌层68例，深肌层及外膜层52例；淋巴结转移者41例，无转移者79例；有脉管癌栓形成47例，无脉管癌栓形成73例；根据TNM分期临床分期：Ⅰ+Ⅱ期70例，Ⅲ+Ⅳ期50例。

1.2主要试剂兔抗人VE-cadherin多克隆抗体以及鼠抗人单克隆抗体VEGF购自Lifespan Bioscience公司，鼠抗人单克隆抗体CD34、CTSD和HIF-1α均购自北京中杉金桥公司；DAB显色试剂盒和二抗试剂盒均购自福州迈新公司，PAS染色试剂盒购自上海贝索生物公司。

1.3方法

1.3.1免疫组化 采用10%中性福尔马林固定新鲜ESCC切除标本，常规石蜡包埋组织，4 μm厚连续切片，常规烤片、脱蜡、水化、抗原修复后，按照免疫组化EnVision两步法试剂盒说明书检测ESCC组织中HIF-1α、CTSD、VEGF和VE-cadherin的表达，实验用已知阳性切片作为对照，阴性以PBS代替一抗作为对照。

1.3.2CD34/PAS双染 根据免疫组化EnVision两步法对CD34进行染色，并经DAB显色，根据PAS试剂盒依次滴加0.5%高碘酸1滴，还原10 min；水流冲洗10 min后将切片平放于避光湿盒中，滴加Schiff试剂1滴，置于37 ℃孵箱反应20 min，待目测组织变红，细蒸馏水冲洗20 min终止反应；再滴加Mayer苏木精染液1滴，复染细胞核2 min；温水返蓝1 min，常规脱水、封固。正常胃黏膜呈紫红色为PAS阳性对照片。

1.4结果判断

1.4.1免疫组化染色判断 CTSD、VEGF阳性信号均定位于胞质，VE-cadherin阳性信号定位胞膜/胞质，HIF-1α阳性信号定位胞核。每例标本选择含有阳性细胞的高倍视野(×400)5个，每视野200个细胞，根据阳性染色强度进行评分：阴性为0分，淡黄色为1分，深黄色为2分，棕色为3分；根据阳性细胞数进行评分：≤10%为0分，10%～30%为1分， 30%～70%为2分，≥70%为3分。将两项积分相乘得出总分：<3分为阴性，≥3分为阳性。

1.4.2CD34/PAS双染VM评判法 显微镜下VM由肿瘤细胞围城管腔，无内皮细胞；腔内有或无红细胞；PAS部分或全部阳性；免疫组化CD34阴性均可判定为VM。VM的评判由三位长期从事病理诊断的高年资医师采用盲法读片。

1.5统计学方法所有实验数据均采用统计学软件SPSS 22.0进行分析，实验指标阳性差异采用χ2检验，当理论值较小时，采用校正χ2检验；相关性采用Spearman相关分析；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1HIF-1α和CTSD表达与ESCC临床病理特征的关系120例ESCC中HIF-1α阳性51例(42.5%)(图1)，CTSD阳性57例(47.5%)(图2)；HIF-1α和CTSD阳性在不同年龄组和不同性别之间表达差异无显著性(P均>0.05，表1)，但HIF-1α、CTSD阳性在浸润至深肌层及外膜层组、淋巴结转移组、Ⅲ+Ⅳ期组、低分化组、脉管癌栓形成组明显增高，差异有统计学意义(P均<0.05，表1)。

2.2ESCC中存在VM现象120例ESCC中，有25例(25/120，20.4%)具有典型VM结构。VM是由肿瘤细胞构成的管腔样结构，该管腔样结构无内皮细胞，腔内可见红细胞或无红细胞，肿瘤细胞和红细胞之间被PAS阳性物质分开，且VM周围无坏死的肿瘤细胞及炎细胞浸润(图3)。不论管腔内有无红细胞，管壁出现CD34阳性的血管，均为内皮依赖性血管(图4)。

2.3ESCC中CTSD表达与VM的相关性120例ESCC中有VM组CTSD阳性率明显高于无VM组，两者之间呈正相关(r=0.375，P=0.000，表2)。

2.4ESCC中CTSD表达与VM标志性分子HIF-1α、VE-cadherin、VEGF的相关性120例ESCC中HIF-1α阳性组CTSD阳性率明显高于HIF-1α阴性组，差异有统计学意义，两者呈正相关(r=0.296，P=0.001)。另外，VE-cadherin阳性率40.8%(49/120)(图5)。CTSD阳性组VE-cadherin的表达明显高于CTSD阴性组，差异有统计学意义，两者呈正相关(r=0.466，P=0.000)。VEGF阳性率51.7%(62/120)(图6)。CTSD阳性组VEGF的表达明显高于CTSD阴性组，差异有统计学意义，两者呈正相关(r=0.452，P=0.000，表3)。

3 讨论

ESCC是常见的消化道恶性肿瘤之一，易局部浸润和转移，因此其病死率较高；肿瘤浸润和转移与其血管生成关系密切。VM是一种不依赖于内皮细胞新的血液供应模式。研究表明[8-9]，VM与肿瘤恶性程度有关，往往生长越快恶性程度越高，侵袭性越强的肿瘤形成VM的可能性越大，甚至VM可以做为恶性肿瘤预后不良指标。本组结果显示，在ESCC中CTSD和HIF-1α阳性与患者年龄、性别无关，但与淋巴结转移、癌栓形成、临床分期、病理分级等有关；提示其参与ESCC的转移与浸润。因此，CTSD有可能参与ESCC VM形成过程，同时也证实HIF-1α参与VM形成以及可以做为预后不良指标。

表1 HIF-1α和CTSD表达与ESCC临床病理特征的关系

①②③④⑤⑥

图1ESCC中HIF-1α呈阳性，EnVision两步法图2ESCC中CTSD呈阳性，EnVision两步法图3ESCC中VM(箭头所示)，CD34呈阴性，EnVision两步法图4ESCC中内皮性血管(箭头所示)，CD34呈阳性，EnVision两步法图5ESCC中VE-cadherin呈阳性，EnVision两步法图6ESCC中VEGF呈阳性，EnVision两步法

表2 ESCC中CTSD表达与VM相关性

表3 ESCC中CTSD与HIF-1α、VE-cadherin、VEGF表达的相关性

在恶性肿瘤VM形成过程中除肿瘤细胞自身变形外，细胞外基质降解重塑也是其关键步骤。因此，经典VM形成机制认为[10-13]HIF-1α间接或直接诱导VE-cadherin和VEGF表达，然后通过各级信号级联反应最终激活基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP)，从而降解细胞外基质，促进肿瘤细胞游离并围成血管样的通道从而形成VM。缺氧是恶性肿瘤常见微环境，在恶性肿瘤中，缺氧诱导CTSD表达重新分布并升高，此外CTSD和MMP同样具有降解细胞外基质，促使其重塑作用。然而，CTSD与ESCC VM之间关系目前尚不清楚，本组结果显示ESCC中CTSD在VM组的阳性率显著高于无VM组；且HIF-1α、VE-cadherin和VEGF在CTSD阳性组的表达率均明显高于CTSD阴性组，并且均与CTSD呈正相关；众多研究表明由缺氧诱导形成VM的经典信号通路中，VEGF[14]、VE-cadherin[15]是关键性因子，提示CTSD可能通过促进肿瘤中VE-cadherin、VEGF表达，从而参与ESCC中VM形成。

综上所述，本实验结果提示在ESCC中CTSD可能在缺氧诱导下促进VEGF、VE-cadherin表达等参与ESCC VM形成，从而促进ESCC转移和浸润，同时也证实CTSD、HIF-1α和VM三者可以联合检测作为预后不良的指标，但CTSD和VM之间具体信号通路及机制目前尚不清楚，对于CTSD在VM形成中的作用及两者之间可能存在的信号通路是我们今后分析的重点。另外，进一步探讨CTSD与VM的关系对于临床抗肿瘤血管治疗和相关药物开发具有重要指导意义。

[1] Li S, Meng W, Guan Z,etal. The hypoxia-related signaling pathways of vasculogenic mimicry in tumor treatment[J]. Biomed Pharmacother, 2016,80:127-135.

[2] Geis T, Popp R, Hu J,etal. HIF-2alpha attenuates lymphangiogenesis by upregulating IGFBP1 in hepatocellular carcinoma[J]. Biol Cell, 2015,107(6):175-188.

[3] 廖世平，高 青. 血管生成拟态及相关蛋白Mig-7、MMP-2 在胃癌组织中的表达及临床意义[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2013,29(2):194-196.

[4] Hendrix M J, Seftor E A, Meltzer P S,etal. Expression and functional significance of VE-cadherin in aggressive human melanomacells: role in vasculogenic mimicry[J]. Proc Nat Acad Sci USA, 2001,98(14):8018-8023.

[5] Raja R, Kale S, Thorat D,etal. Hypoxia-driven osteopontin contributes to breast tumor growth through modulation of HIF-1α-mediated VEGF-dependent angiogenesis[J]. Oncogene, 2013,33(16):2053-2064.

[6] 展翼翼，达春丽，刘春玲. 肺腺癌中CD44v6和组织蛋白酶D的表达及临床意义[J]. 中国老年学杂志, 2017,37(1):119-121.

[7] 张志林，肖 蓉，李庆伟. 组织蛋白酶D的功能多样性[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2014,30(7):647-654.

[8] Mao X G, Xue X Y, Wang L,etal. CDH5 is specifically activated inglioblastoma stemlike cells and contributes to vasculogenic mimicry induced by hypoxia[J]. Neuro Oncol, 2013,15(7):865-879.

[9] Wang S Y, Ke Y Q, Lu G H,etal. Vasculogenic mimicry is a prognostic factor for postoperative survival inpatients with glioblastoma[J]. J Neuro Oncol, 2013,112(3):339-345.

[10] 倪小晴，张佐阳，吴继锋. HIF-1α蛋白在胃癌中的表达及其与Wnt信号通路、上皮-间质转化的关系[J]. 临床与实验病理学杂志, 2014,30(2):140-144.

[11] Zhu W, Sun W, Zhang J T,etal. Norcantharidin enhances TIMP-2 anti-vasculogenic mimicry activity for human gallbladder cancersthrough downregulating MMP2 and MT1-MMP[J]. Int J Oncol, 2015,46(2):627-640.

[12] 李欣焱，吴淑华，孙晨博，等. Raptor、Rictor与结直肠癌血管生成的相关性及其临床意义[J]. 临床与实验病理学杂志, 2017,33(2):129-134.

[13] Liu X, Wang J, Li S,etal. Histone deacetylase 3 expression correlates with vasculogenic mimicry through the phosphoinositide3-kinase/ERK-MMP-laminin5γ2 signaling pathway[J]. Cancer Sci, 2015,106(7):857-866.

[14] Liang X, Xu F, Ma C,etal. VEGF signal system: the application of antiangiogenesis[J]. Curr Med Chem, 2014,21(7):894-910.

[15] Tang N N, Zhu H, Zhang H J,etal. HIF-1alpha induces VE-cadherin expression and modulates vasculogenic mimicry in esophagealcarcinoma cells[J]. World J Gastroenterol, 2014,20(47):17894-17904.

CorrelationoftheexpressionofHIF-1αandCTSDwithvasculogenicmimicryanditsclinicopathologicalfeaturesinesophagealsquamouscellcarcinoma

ZHOU Fang-fang, LU Lin-ming, CHEN Bing

(DepartmentofPathology,WannanMedicalCollege,Wuhu241000,China)

PurposeTo investigate the expression of vasculogenic mimicry (VM) and hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α), cathepsin D (CTSD) in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and its relationship with clinicopathological parameters.Methods120 specimens of primary ESCC and their clinical data were collected. Dual staining of CD34 and PAS were performed to validate the existence of VM in ESCC. Immunohistochemical of EnVision two-step method was used to detect the expression of VM-related markers vascular endothelial cadherin (VE-cadherin) and vascular endothelial grow factor (VEGF), HIF-1α and CTSD in 120 cases of ESCC. The relationship between HIF-1α, CTSD and clinical pathological parameters were analyzed.ResultsThe positive rate of HIF-1α, CTSD was correlated with infilatrating, lymph node metastasis, clinical stage and cancer embolus. VM existed in 25 of 120 cases. The expression of HIF-1α and CTSD in cases with VM was obviously higher than that without VM, the expression of HIF-1α and CTSD was positively correlated with VM in ESCC. The expression of CTSD in case with HIF-1α was obviously lower than that without HIF-1α, the expression of CTSD was positively correlated with HIF-1α in ESCC. The expression of VE-cadherin and VEGF in cases with CTSD was obviously higher than that without CTSD, the level of VE-cadherin and VEGF expression was positively correlated with CTSD in ESCC.ConclusionCTSD may promote VM formation in ESCC via HIF-1α. High expression of HIF-1α and CTSD indicate poor prognosis of ESCC patients.

esophageal neoplasm; squamous cell carcinoma; hypoxia inducible factor-1α; cathepsin D; vasculogenic mimicry

时间：2017-9-18 6:23 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170918.0623.008.html

R 735.1

A

1001-7399(2017)09-0977-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.09.008

2017年安徽高校自然科学研究重点项目(KJ2017A249)、2017年皖南医学院中青年科研基金(WK201710)

皖南医学院病理学教研室，芜湖 241000

周芳芳，女，硕士，助教。E-mail: zff2468@163.com

卢林明，男，硕士，副教授，通讯作者。E-mail: 3156214539@qq.com