鲤春病毒RT-PCR检测方法的建立与应用

吴 斌 赵 娜 张 琳 肇慧君

（辽宁出入境检验检疫局，辽宁大连 116000）

鲤春病毒RT-PCR检测方法的建立与应用

吴 斌 赵 娜 张 琳 肇慧君

（辽宁出入境检验检疫局，辽宁大连 116000）

本文根据鲤春病毒糖蛋白设计并合成引物，对SVCV进行扩增鉴定，对所建立的RT-PCR方法进行灵敏度和特异性实验，实验结果表明，只有SVCV能够扩增出特异性片段，大小为714bp，对照组核酸均没有扩增，表明所设计的引物具有良好的特异性，方法的灵敏度为10-5。利用建立的方法对人工感染SVCV的鲤鱼进行检测，实验结果表明，2个感染样品中均检出SVCV病毒。本实验建立的RT-PCR为SVCV检测诊断提供了新的技术手段。

鲤春病毒（SVCV）；RT-PCR；特异性；灵敏度；人工感染

鲤春病毒血症（Spring viraemia of carp，SVC）是一种由鲤春病毒（SVCV）引起的急性出血并伴有高度传染的流行病，对渔业生产将带来极大危害甚至是毁灭性的风险。鲤科是SVCV最容易感染的鱼类，一般在鲤、锦鲤、草鱼、鲢、鳙、鲫等鱼中都能够产生明显的病症，但鲤是这几种鱼中最敏感的宿主，SVC发病的特征为腹部涨水、鱼体渗血、发病急并且死亡率很高，通常在春季暴发并引起急性死亡。SVC最早流行于欧洲、中东和俄罗斯，2008年，我国将鲤春病毒血症列为一类动物疫病并添加在新颁布的动物疫病名录中[1]。本文建立了SVCV的RT-PCR检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒

实验室保存的冻存毒株，经细胞系FHM增殖得到SVCV，用于特异性分析的传染性胰腺坏死病毒（IPNV）、传染性造血器官坏死病毒（IHNV）、病毒性出血败血症病毒（VHSV）均为实验室保存。

1.1.2 仪器和试剂

（1）仪器

RT-PCR仪：美国ABI公司生产的9700PCR仪。

电泳仪：美国Bio-rad生产的A101439。

（2）试剂

PrimeScript™OneStepRT-PCRKitVer.2（DyePlus）、TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0购自宝生物公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

根据SVCV糖蛋白基因设计引物并由宝生物（大连）有限公司合成（表1）。

表1 SVCV RT-PCR引物

1.2.2 一步法RT-PCR

反应总体系为50μl，分别为2×One-Step Buffer25μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix2μL，RT-PCR Forward Primer（10uM）1μl，RT-PCR Reverse Primer（10uM）1μL，DEPC处理的灭菌双蒸15μl，将 5μL的RNA加入到体系中，充分混匀，简单离心，置于PCR仪中。反应条件为：50℃逆转录30min，min，95℃预变性2 min，95℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 1min s，35个循环，最后 72℃ 延伸10min，4℃保存。PCR 产物用 1.5 %的琼脂糖凝胶电泳（90V，15min）进行分析。

2 结果与讨论

2.1 病毒扩增鉴定结果

在病毒提取完毕后，对所提取的RNA进行RT-PCR扩增，其扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，标准条带为Marker 2000，其电泳图片如下。结果表明，SVCV具有清晰明显的条带，大小为714bp。

图1 SVCV扩增RT-PCR产物电泳结果

2.2 特异性实验结果

根据合成的两条引物对VHSV、SVCV、IPNV、IHNV进行特异性扩增实验，结果如图2，只有SVCV出现清晰明显的条带，大小为714bp，其他三种核酸没有特异性条带出现。

图2 特异性实验PCR电泳图

2.3 敏感性实验结果

将已测定病毒的SVCV进行10倍稀释，按照1.2.3进行RNA提取，以10 倍系列稀释RNA10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、阳性对照为模板，进行RT-PCR 敏感性检测，结果显示该方法的最低可以检测出10-5（图3）

图3 灵敏性实验PCR电泳图

2.4 对人工感染鲤鱼鉴定结果

人工感染的草鲤鱼，在注射的第四周末出现无目的漂游，与对照组相比较，没有积极进食表现。第五周后病鱼体色深，腹部肿大（如图4 A），皮肤有明显出血现象（图4B，C），出现感染鲤春病毒血症的典型症状。

图4 出现典型症状的实验组鱼和健康草鲤鱼鱼对比图

人工感染的带有典型病症的鲤鱼样品RNA经过RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳结果显示。其中，经人工感染SVCV的病鱼样品RNV通过RT-PCR得到的产物，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳得到的结果如图5，SVCV病鱼样品的到了与阳性质粒与相同大小的片段714bp，说明鲤鱼被成功感染鲤春病毒。

图5 感染SVCV病鱼样品RT-PCR结果图

3 结论

本文根据鲤春病毒糖蛋白设计并合成引物，对SVCV进行扩增鉴定，对所建立的RT-PCR方法进行灵敏度和特异性实验，实验结果表明，只有SVCV能够扩增出特异性片段，大小为714bp，对照组核酸均没有扩增，表明所设计的引物具有良好的特异性，方法的灵敏度为10-5。因为普通RT-PCR和套式PCR相结合的方法可以增强实验灵敏度、增强检测的敏感性、可靠性。利用建立的方法对人工感染SVCV的鲤鱼进行检测，实验结果表明，2个感染样品中均检出SVCV病毒。本实验建立的RT-PCR为SVCV检测诊断提供了新的技术手段。

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国家质检公益项目（201410059）

吴斌（1968—），女，辽宁大连人，博士研究生，研究员，主要从事水生动物疫病研究。