胎儿弯杆菌的几种检测方法

2017-11-17王向林

兽医导刊 2017年16期

关键词：亚种单克隆生化

王向林

（内蒙古赤峰市巴林右旗动物疫病预防控制中心，内蒙古赤峰 024000）

胎儿弯杆菌的几种检测方法

王向林

（内蒙古赤峰市巴林右旗动物疫病预防控制中心，内蒙古赤峰 024000）

胎儿弯杆菌属于弯杆菌属的成员，包括胎儿弯杆菌胎儿亚种和性病亚种。自McFadyean等（1913）从流产绵羊的阴道分泌物中分离到弧菌样微生物以来，国内外学者己对胎儿弯杆菌进行大量研究，发现胎儿弯杆菌呈世界性分布，是危害人或动物健康的重要病原微生物之一。胎儿弯杆菌胎儿亚种致绵羊流产和牛的散发性流产，性病亚种可致牛流产和不育. 也可感染人引致流产、早产、败血症以及类似布鲁菌病的症状，尤其是患有免疫缺陷症的人，感染胎儿弯杆菌后能引起脑膜炎、菌血症、关节炎、腹泻等疾病。胎儿弯杆菌严重威胁着人类的健康并给畜牧业造成重大经济损失，对于该菌的检测鉴定就尤为重要。

胎儿弯杆菌；鉴定；检测

之前，国内对于胎儿弯杆菌病的诊断方法主要依赖于生化实验，例如硫化氢产生试验、氧化酶实验以及1%甘氨酸生长试验等。随着分子生物学的不断发展，目前主要采用PCR方法，DNA指纹印迹，脉冲场凝胶电泳，ELISA等方法对胎儿弯杆菌进行鉴定。本文将对胎儿弯杆菌现有的几种检测方法进行阐述说明。

1 胎儿弯杆菌鉴定的国家标准

（1）筛选鉴定：将典型或可疑纯培养物做革兰氏染色，湿涂片动力观察、氧化酶试验及过氧化氢酶试验。胎儿弯杆菌为革兰氏阴性，呈螺旋状或“S’状，一些老龄培养物可出现球状或球杆状，不形成芽孢和夹膜，在菌体的一端或两端有鞭毛，呈特征性快速螺旋状穿梭运动。氧化酶试验均为阳性。

（2）生化试验：将上述筛选鉴定出的纯培养物按表1进行生化试验，所有生化试验管均于混合气体环境中培养3d。

（3）结果判定：根据上述两项实验结果进行判定。凡符合胎儿弯杆菌一般特征的细菌，按表1的生化反应特征进一步判定是否为“胎儿弯杆菌胎儿亚种”或“胎儿弯杆菌性病亚种”，在判定亚种时，在表1的生化反应中，有一项不符合均判定为非胎儿弯杆菌。

2 PCR方法检测鉴定胎儿弯杆菌

Masaki Fujita等用内切酶SalI和SmaI分别酶切21株胎儿弯杆菌的基因组DNA，利用脉冲电场凝胶电泳获得它们的指纹图谱，然后分析各菌株间的系统进化关系，为研究胎儿弯杆菌的流行病学研究提供了方便。I.V.Wesley等利用胎儿弯杆菌的16SRNA的基因序列的高变区，设计了2个寡核昔酸探针（5'-CTC AAC TTTCTA GCA AGCT AGC ACT CTC T-3'和5'-CTCA ACT TTC TAC CAA G-3'），用于检测57株胎儿弯杆菌，并用Southem杂交法证明这两个探针具有检测胎儿弯杆菌的特异性。和传统的检测方法相比，核酸探针检测胎儿弯杆菌具有快速、特异、敏感的特点。

3 ELISA方法检测胎儿弯杆菌

3.1 国外的ELISA检测方法

Brooks等在2004年以单克隆抗体为基础利用ELISA方法用来检测胎儿弯杆菌牛包皮清洗物和阴道分泌物样本，以此作为检测胎儿弯杆菌的推定筛选试验。他们总共检测了725份是从各地收集的诊断样品通过增菌运输培养基培养，利用分离培养的胎儿弯杆菌作为阳性判定标准。检测样品在增菌运输培养基上通过4～5d的培养后用作ELISA检测。以夹心ELISA方法作为检测的主要方法，其主要抗原为胎儿弯杆菌脂多糖。以兔抗胎儿弯杆菌的血清作为捕获抗体，利用抗胎儿弯杆菌脂多糖核心蛋白B及O和毒素A的单抗与标记的山羊抗鼠辣根过氧化物酶作为诊断抗体。ELISA结果显示有708份样品为胎儿弯杆菌阴性，有17份样品为阳性，这与增菌运输培养基培养鉴定的结果完全一致。该实验结果显示ELISA方法在胎儿弯杆菌临床样品的检测中起到非常重要的作用，单克隆抗体用于检测胎儿弯杆菌时具有很高的特异性，可作为鉴定胎儿弯杆菌的潜在性免疫诊断试剂。

3.2 国内的ELISA检测方法

赵海玲等对胎儿弯杆菌的毒力起重要作用的表面蛋白基因SapA为研究对象，采用PCR技术扩增出基因片段SapA-N（1398bp）和SapA-C（1422bp），在大肠杆菌中表达并对重组蛋白进行纯化和抗原活性的比较研究。在此基础上应用胎儿弯杆菌表面蛋白SapA-N作为抗原建立一种能快速有效地检测胎儿弯杆菌病的间接ELISA方法，为监测疫情和研究该病病原的特性提供良好方法。在上述研究基础上以重组表达的胎儿弯杆菌杆菌表面蛋白rSapA-N免疫小鼠，利用细胞融合技术制备单克隆抗体，经过亚克隆后得到了2株杂交瘤细胞。利用获得的单克隆抗体鉴定胎儿弯杆菌毒力因子表面蛋白，为建立胎儿弯杆菌快速鉴定方法奠定了基础。