（－）－棉酚及（－）－醋酸棉酚原料药的稳定性研究

张欢，唐辉，刘艳芳，吴旭东，陈欢

（石河子大学药学院／新疆特种植物药资源教育部重点实验室，石河子832002）

棉酚（Gossypo1）又称棉籽醇，是天然存在于锦葵科棉属植物棉花的种子、叶茎以及根部等器官中的一种黄色多元酚类化合物，本身为消旋体，其分子中两个萘环之间存在阻转异构现象，具有手性轴，有左、右旋体［1］。棉酚具有抗肿瘤、抗病毒和抗菌等作用［2－4］。现有的研究已表明棉酚的药理作用与其分子手性结构相关，（－）－棉酚的活性比（＋）－棉酚强，（－）－棉酚是（±）－棉酚的主要药用活性成分，其对细胞的敏感性及对细胞的杀伤作用是（±）－棉酚的5倍多［5］，且毒副反应小［6］。棉酚分子中的酚羟基极易氧化而降低其药用活性，故常将棉酚与冰醋酸络合形成更稳定、更利于保存和运输的醋酸棉酚配合物，目前已上市的棉酚制剂亦多为醋酸棉酚片剂。

关于棉酚及其衍生物稳定性的研究较少［7］，本课题组已报道［8］棉酚原料药的稳定性，本文旨在考察热、湿、光对高活性的（－）－棉酚及（－）－醋酸棉酚原料药稳定性的影响，为该药原料标准制定新制剂的研究奠定一定理论基础。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 仪器

美国Agilent 1100高效液相色谱仪；德国SartoriusBP211D电子天平；北京泰克X－5型显微熔点测定仪；宁波东南RXZ－300C型智能人工气候箱；法国MOS 450圆二色谱仪；美国Autopol V旋光仪。

1．1．2 试药

棉酚对照品（美国SIGMA公司，含量95%，Lot 20k4057）；（－）－棉酚样品3批（自制）；（－）－醋酸棉酚样品3批（自制）；（＋）－棉酚样品（自制）；（＋）－醋酸棉酚样品（自制）；磷酸、甲醇、氯仿（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）；甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；水为重蒸水。

1．2 方法

1．2．1 熔点测定

取（－）－棉酚及（－）－醋酸棉酚样品适量，以 X－5型显微熔点测定仪（使用前已校正）测定，每份样品重复测定3次。

1．2．2 比旋度测定

精密 称 取 （－）－棉 酚 及 （－）－醋 酸 棉 酚 样 品 各 9 mg，置于10mL容量瓶中，以重蒸氯仿溶解并定容，摇匀，以旋光仪测定。

1．2．3 旋光特性

精密称取（－）－棉酚、（－）－醋酸棉酚、（＋）－棉酚及（＋）－醋酸棉酚样品各2mg，置于25mL容量瓶中，以重蒸氯仿溶解并定容，摇匀，以圆二色谱仪测定。

1．2．4 色谱条件

色谱柱为 Wondasil C18Column（4．6mm×150 mm，5μm），流动相为甲醇：0．7%磷酸水＝85∶15，流速1．0mL／min，检测波长238nm，柱温25℃，进样量20μL。

1．2．5 色谱条件的方法学考察

1．2．5．1 标准曲线

精密称取棉酚对照品12．50mg，置于50mL容量瓶中，甲醇溶解定容，摇匀，作为对照品溶液。分别精密移取对照品溶液1．0、2．0、3．0、4．0、5．0、6．0 mL置于25mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，成为标准系列溶液。各取20μL，注入 HPLC仪，记录色谱图。

1．2．5．2 精密度及回收率试验

取质量浓度为30μg／mL的对照品溶液，连续进样5次，计算精密度。精密称取已知含量的（－）－棉酚样品（批号：100123），分别加入相对于样品含量80%、100%、120%3种不同比例的对照品及甲醇。平行操作3次，计算加样回收率。

1．2．5．3 样品含量测定

精密 称 取 （－）－棉 酚 及 （－）－醋 酸 棉 酚 样 品 各 5 mg，置于10mL容量瓶中，甲醇溶解定容，移取0．6 mL置于10mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，成为样品溶液。按标准曲线绘制项下方法操作，根据标准曲线计算含量。

1．2．6 稳定性试验

1．2．6．1 高温试验

取精密称重后的（－）－棉酚及（－）－醋酸棉酚样品，置已知质量的称量瓶中（去盖），铺成5mm厚的薄层，置人工气候箱内，于40℃恒温条件下放置10d，分别在第5天、第10天取样考察。

1．2．6．2 高湿试验

取精密称重后的（－）－棉酚及（－）－醋酸棉酚样品，置已知质量的称量瓶中（去盖），铺成5mm厚的薄层，置人工气候箱内，于相对湿度75%、温度25℃条件下放置10d，分别在第5天、第10天取样考察。

1．2．6．3 强光照试验

取精密称重后的（－）－棉酚及（－）－醋酸棉酚样品，置已知质量的称量瓶中（去盖），铺成5mm厚的薄层，置人工气候箱内，于光照照度4500Lx±500Lx条件下放置10d，分别在第5天、第10天取样考察。

1．2．6．4 长期试验

取（－）－棉酚及（－）－醋酸棉酚样品适量，真空封装于锡箔包装纸内，置人工气候干燥箱内，于温度40℃，相对湿度RH75%条件下放置6个月，每个月取样测定。

1．2．6．5 加速试验

取（－）－棉酚及（－）－醋酸棉酚样品适量，真空封装于锡箔包装纸内，置人工气候干燥箱内，于温度25℃，相对湿度RH60%条件下放置6个月，每个月取样测定。

1．2．6．6 留样考察

取（－）－棉酚及（－）－醋酸棉酚样品适量，真空封装于锡箔包装纸内，置于冰箱中（5℃）冷藏放置6个月，每个月取样测定。

2 结果

2．1 理化性质

2．1．1 性状

（－）－棉酚为黄色粉末，（－）－醋酸棉酚为棕黄色粉末。

2．1．2 熔点

（－）－棉酚的熔点为180．0～182 ℃，（－）－醋酸棉酚的熔点为176．5～178．2℃。

2．1．3 旋光度

（－）－棉酚的比旋度［α］20D＝－353，（－）－醋酸棉酚的比旋度［α］20D＝－80．3。（－）－棉酚的比旋度值与文献报道（［α］15D＝－354．2）相近［8］，（－）－醋酸棉酚的比旋度值未见报道。

2．1．4 旋光特性

圆二色谱图见图1、图2。由图可知（－）－棉酚与（＋）－棉酚、（－）－醋酸棉酚与（＋）－醋酸棉酚的圆二色谱图均呈镜像关系，对应波长处的Cotton效应相 反，说明两两互为对映异构体。

图1 （＋）－棉酚和（－）－棉酚 CD图谱Fig．1CD chromatogram of（＋）－gossypol and（－）－gossypol

图2 （＋）－醋酸棉酚和（－）－醋酸棉酚 CD图谱Fig．2CD chromatogram of（＋）－gossypol acetic acid and（－）－gossypol acetic acid

2．2 含量测定

2．2．1 标准曲线

其液相色谱图见图3。

图3 棉酚HPLC色谱图Fig．3HPLC chromatogram of gossypol

以对照品浓度作为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得回归方程y＝149．71x－422．3，R2＝0．9992，结果表明（－）－棉酚质量浓度为10～60μg／mL时线性关系良好，棉酚的保留时间约为8．2min。

2．2．2 精密度及回收率结果

精密度RSD＝0．1%（n＝5）；平均回收率为99．55%，RSD 为0．79%。

2．3 稳定性［9－10］

2．3．1 高温试验

第5天、第10天时样品性状无变化且未发生消旋化，含量、熔点及比旋度变化见表1。可见样品对高温不稳定。

表1 高温试验n＝3Tab．1The experiment of high temperature condition

2．3．2 高湿试验

第5天、第10天时样品性状无变化且未发生消旋化，含量、熔点及比旋度变化见表2。可见样品对高湿不稳定。

表2 高湿试验n＝3Tab．1The experiment of high wet condition

2．3．3 强光照射试验

第5天、第10天时样品性状无变化且未发生消旋化，含量、熔点及比旋度变化见表3。可见样品对强光不稳定。

表3 强光照射试验n＝3Tab．3The experiment of highlight condition

2．3．4 加速试验

样品的外观性状无变化且未发生消旋化，（－）－棉酚和（－）－醋酸棉酚的含量分别下降了7．87%和3．76%，说明样品对湿热相对不稳定。

2．3．5 长期试验

样品的外观性状无变化且未发生消旋化，（－）－棉酚和（－）－醋酸棉酚的含量分别下降了4．15%和1．87%，说明样品对湿热相对不稳定。

2．3．6 留样考察

样品的外观性状无变化且未发生消旋化，（－）－棉酚和（－）－醋酸棉酚的含量分别下降了1．47%和0．43%，说明样品在该条件下相对稳定，且（－）－醋酸棉酚比（－）－棉酚稳定。

3 讨论

以 HPLC法定量时，（±）－棉酚、（－）－棉酚及（－）－醋酸棉酚的出峰时间一致，故以（±）－棉酚作对照品测含量。（－）－棉酚和（－）－醋酸棉酚为本实验室自制，薄层显示为一个斑点，经质谱MS和核磁共振NMR的结构鉴定，结果与文献报道［11］一致。

本试验以棉酚稳定性研究的报道为基础，考察了（－）－棉酚和（－）－醋酸棉酚原料药的稳定性，选用了专属性更强，灵敏度更高的HPLC法检测其含量变化，结果更准确。

由稳定性试验结果可看出，样品在高温、高湿、强光照射条件下均不稳定，含量明显下降；在长期、加速试验条件下含量下降较少；在避光冷藏条件下相对稳定，故在生产应用中样品应置于避光、阴凉、干燥处保存。

［1］James A K．Reaction chemistry of gossypol and its derivatives［J］．JAOCS，2006，83（4）：269－302．

［2］Baram N I，Ismailov A I，Ziyaev K L，et al．Biological activity of gossypol and its derivatives［J］．Chemistry of Natural Compounds，2004，40（3）：199－205．

［3］Turco E，Vizzuso C，Franceschini A，et al．The in vitro effect of gossypol and its interaction with salts on conidial germination and viability of Fusarium oxysporum sp．vasinfectum isolates［J］．Journal of Applied Microbiology，2007，103（6）：2370－2381．

［4］Catherine V P，Andrew D S，Marcus M R，et al．Oral gossypol in the treatment of patient with refractory metastatic breast cancer：A phase I／II clinical trial［J］．Breast Cancer Research and Treatment，2001，66（3）：239－248．

［5］Blackstaffe L，Shelley M D，Fish R G．Cytotoxicity of gossy－pol enantiomers and its quinone metabolite gossypolone in melanoma cell lines［J］．Melanoma Res，1997，7（5）：364－372．

［6］Liu S，Kulps K，Sugimoto Y，et al．The （－）－enantiomer of gossypol possesses highter anticancer potency than racemic gossypol in human breast cancer［J］．Anticancer Res，2002，22（1）：33－38．

［7］陆莲英．影响棉酚稳定性的若干因素［J］．中国棉花，1989（1）：22－24．

［8］黄洪勇，唐辉，关丽，等．棉酚原料药的理化性质及稳定性研究［J］．时珍国医国药，2010，21（2）：309－310．

［9］Jiang H X，Cao X X，Huang H，et al．An expedient route for the practical preparation of optically active（－）－gossypol［J］．Tetrahedron：Asymmetry，2007，18（20）2437－2441．

［10］苏志德．醋酸艾司利卡西平片的制备及其稳定性研究［J］．中国药房，2010，21（37）：3509－3510．

［11］Jiang H X，Zhang L．Chiral gossypol derivatives：evaluation of their anticancer activity and molecular modeling［J］．European Journal of Medicinal Chemistry，2009，44（10）：3961－3972．