浓酱兼香型酒醅中产酱香芽孢杆菌的筛选及发酵风味成分分析

王 霜，缪礼鸿*，张明春，刘蒲临，刘俊超

（1.武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023；2.湖北白云边酒业股份有限公司，湖北 松滋 434200）

浓酱兼香型酒醅中产酱香芽孢杆菌的筛选及发酵风味成分分析

王 霜1，缪礼鸿1*，张明春2，刘蒲临1，刘俊超1

（1.武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023；2.湖北白云边酒业股份有限公司，湖北 松滋 434200）

该研究从兼香型白酒不同轮次酒醅中筛选到两株碱性蛋白酶活较高并对乙醇具有较好耐受性的菌株，分别为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）LS9和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）S10，其液态发酵产碱性蛋白酶活性分别可达（163.82±15.85）U/mL和（241.69±20.07）U/mL，二者均能在含体积分数6%乙醇的培养基中生长良好。菌株LS9和S10均能产生典型的酱香风味。气质分析结果表明，菌株LS9和S10发酵后代谢产生了5-甲基糠醛、β-苯乙醇、苯乙酸、α-亚麻酸等新的风味成分。菌株LS9和S10在小麦固体培养基中均具有一定的发酵产乙偶姻能力，在28℃恒温条件下乙偶姻产量分别为（65.15±6.15）mg/L和（41.33±4.82）mg/L，35℃→45℃→55℃升温培养条件下的乙偶姻产量分别为（41.21±3.27）mg/L和（26.91±2.97）mg/L。

兼香型酒醅；芽孢杆菌；碱性蛋白酶活；风味成分

浓酱兼香型白酒是在我国传统酱香型和浓香型白酒的基础上发展起来的，其中白云边酒是浓酱兼香型白酒的典型代表[1]，其采用大曲酱香型白酒和浓香型白酒相结合的生产工艺，前6轮为酱香型生产工艺，后3轮采用浓香型生产工艺[2-3]。因此酱香型白酒的生产工艺对兼香酒的出酒率及酒品质量具有较大影响。酱香大曲中的微生物代谢产物对酱香白酒的风格具有重要贡献[4-5]。酱香大曲制作过程中微生物代谢产生的蛋白酶可将原料中的粗蛋白降解成各种氨基酸，淀粉酶可将淀粉降解成糖，氨基酸和糖在特定的环境中可发生美拉德反应生成具有酱香风味的物质，此外氨基酸在受热分解时也可产生酱香风味物质[6]。白酒发酵过程中的高产蛋白酶活菌株一方面可提高氨基酸含量，从而增加白酒中的风味物质，另一方面还可提高白酒的产量和质量[7]。高产蛋白酶细菌的分离筛选，有助于酱香大曲中高产蛋白酶微生物的研究，对生产出优良的酱香大曲和酱香白酒具有重要意义[8]。

本研究对浓酱兼香型白酒酒醅中分离出的细菌进行蛋白酶活、产酱香能力及耐酒精能力测定，从中筛选出具有产酱香功能的优良菌株，为开发酱香功能强化曲提供优良菌株来源并为揭示浓酱兼香型白酒酱香风味来源提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株来源及原料

菌株由本实验室从白云边不同轮次入池酒醅和出池酒醅中分离的25株芽孢杆菌[9]，其中地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）11株，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）11株、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）3株。

小麦：由湖北白云边酒业股份有限公司提供。

1.1.2 试剂

福林试剂：上海荔达生物科技有限公司；无水碳酸钠（分析纯）：天津市科密欧化学试剂开发中心；三氯乙酸（分析纯）：上海山浦化工有限公司；磷酸二氢钠（分析纯）、磷酸氢二钠（分析纯）：山东西亚化学工业有限公司；干酪素、酪氨酸（分析纯）：北京奥博星生物技术有限责任公司。无水乙醇（分析纯）、二氯甲烷（CH2Cl2）（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；乙偶姻（分析纯）：上海市麦克林生化科技有限公司。

1.1.3 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、水1 000 mL，pH 7.0～7.2，固体培养基中加入2%的琼脂，121℃灭菌20 min。

葡萄糖蛋白胨液体培养基：蛋白胨5 g、葡萄糖5 g、K2HPO42 g、水1 000 mL，pH 7.0～7.2，115 ℃灭菌20 min。

产蛋白酶发酵培养基[10]：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、蔗糖10g、磷酸氢二钠4g、硫酸镁0.2g、水1000mL，pH7.2，121℃灭菌30 min。

小麦固体培养基：将小麦粉碎后的颗粒和面粉的混合物按料水比1∶0.4加水后浸润过夜，在沸水锅上蒸熟1 h，按照100 g/250 mL分装到三角瓶中，121℃灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

FW177高速粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；ZHJH-CH15B超净工作台、ZXSD-A1270恒温培养箱、ZHWF-2102恒温摇床：上海智城分析仪器制造有限公司；HH-6数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；UV-5900PC分光光度计：上海元析仪器有限公司；RV8V旋转蒸发仪：德国艾卡公司；GC7890A-MS5975C气质联用仪、7820A气相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 高产蛋白酶活菌株的筛选

将分离自白云边酒醅的25株芽孢杆菌经牛肉膏平板活化后接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、170 r/min摇床培养12 h，将培养的种子液按照3%的接种量接种至产蛋白酶发酵培养基中，37℃、170 r/min培养48 h，按照国标福林-酚试剂法测定各菌株发酵液碱性蛋白酶活[11]，单位为U/mL，每个菌株3瓶重复。

1.3.2 产酱香芽孢杆菌的筛选及产乙偶姻芽孢杆菌的培养

从不同种类芽孢杆菌中挑选蛋白酶活大小不同的菌株，接种至葡萄糖蛋白胨液体培养基37℃、170 r/min培养24 h，按照10%的接种比例接种至小麦固体培养基中，并设置空白组（未接种小麦固体培养基），按照35℃→45℃→55℃升温培养，每个温度段各培养2 d，筛选出具有产酱香功能的芽孢杆菌，每个菌株3瓶重复，曲香感官评定标准见表1[12]。综合评分是5个人重复3次试验的综合评价结果，满分10分。

表1 曲香感官评定标准Table 1 Sensory evaluation standards of Daqu flavor

将筛选到的产酱香芽孢杆菌分别置于28℃恒温培养6 d和35℃→45℃→55℃升温培养，每个温度段各培养2 d。测定不同培养温度对乙偶姻含量的影响，每个菌株3瓶重复。

1.3.3 耐酒精能力的测定

向LB培养基中分别加入不同体积比的无水乙醇配制成含不同体积分数乙醇的培养基，将待测菌株经牛肉膏蛋白胨培养液活化后，按0.1%的接种量接入含乙醇的LB培养基中，培养条件为37℃、170 r/min摇床培养，取发酵液稀释后测定OD600nm值，每12 h检测一次。

1.3.4 风味成分分析

（1）风味成分的提取

取方法1.3.2中产酱香发酵样品50 g加入体积分数50%乙醇100mL，30℃超声波处理40min，结束后离心收集上清液，按照上清液体积1∶1加入CH2Cl2，充分混匀后收集萃取相，将收集到萃取液通过减压蒸馏，浓缩至无水，加CH2Cl2定容至5 mL作为最终萃取样品。

（2）气相色谱质谱分析

通过DB-Wax毛细管柱进行气相质谱分析，程序升温条件为：初温50℃，恒温2 min，然后以6℃/min的速率升至230℃，保持30min。进样量：1μL，不分流。载气：氦气（He）；流速：2 mL/min；分离后的样品用Agilent 5975MSD鉴定。质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源；电子能量：70 eV；离子源温度：230℃；扫描范围：30～550 amu[13]。

（3）乙偶姻含量测定

固液萃取：取1.3.2中发酵样品50 g加入体积分数50%乙醇100 mL，30 ℃、170 r/min振荡1 h，结束后加入5 mL CH2Cl2充分混匀静置，收集下层萃取相，8000r/min离心1min取上清液滤膜过滤后即为萃取样品。气相色谱分析方法：样品通过CP-Wax57CB毛细管柱进行分离，程序升温条件：初温80℃，恒温2 min，然后以5℃/min的速率升至200℃，保持30 min。进样量：1 μL，不分流。载气：氮气（N2）；流速：2 mL/min。进样口与检测器温度：200℃。

乙偶姻标准溶液配制：准确称取0.1g乙偶姻，用无水乙醇定容至25 mL，使用前，用无水乙醇分别稀释至25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L，绘制乙偶姻标准曲线，根据测定结果带入标准曲线方程计算乙偶姻含量。

2 结果与分析

2.1 芽孢杆菌蛋白酶活测定结果

对25株芽孢杆菌的碱性蛋白酶活检测，结果见表2。

表2 碱性蛋白酶活检测结果Table 2 Determination results of alkaline protease activity

由表2可知，菌株JCB3-1-1（LS9）和JRB7-1-1N（S10）的蛋白酶活分别为（163.82±15.85）U/mL和（241.69±20.07）U/mL，明显较其他菌株高，其余6株蛋白酶活较高菌株分别为CRB7-1-1N、CRB6-1-2M（LS6）、CCB7-1-1M（S13）、JRB3-1-2、JRB4-1-2和CCB6-1-3M（AS1）。结合以上8株碱性蛋白酶活较高菌来源进行分析后发现，其中有5株菌均分离自不同轮次入池酒醅中。5株产碱性蛋白酶活较低菌株分别为JRB3-1-3（LS23）、JCB4-1-1M（AS3）、CCB7-1-3N、CCB7-1-2N（LS16）和JCB7-1-2N，其中4株均分离自出池酒醅中。以上结果表明，碱性蛋白酶活较高菌株多分离自高温堆积后入池酒醅中，而碱性蛋白酶活较低菌株多分离自发酵结束后出池酒醅中。

2.2 产酱香功能菌株的筛选结果

2.2.1 产酱香能力鉴定

从不同种类芽孢杆菌中选择5株碱性蛋白酶活较高的菌株，编号分别为LS9（JCB3-1-1）、S10（JRB7-1-1N）、S13（CCB7-1-1M）、AS1（CCB6-1-3M）和LS6（CRB6-1-2M）和3株碱性蛋白酶活较低菌株，编号分别为LS23（JRB3-1-3）、LS16（CCB7-1-2N）和AS3（JCB4-1-1M），进行产酱香发酵实验，结果见表3。

表3 不同芽孢杆菌产酱香能力分析Table 3 Sauce flavor production of differentBacillusstrains

由表3可知，菌株LS9和S10两株碱性蛋白酶活较高菌株的产酱香能力明显较其他菌株强，菌株LS9和S10即为筛选得到的产酱香功能菌株。此外菌株LS23、LS16和AS3三株蛋白酶活较低菌株的产酱香能力也明显较弱，表明芽孢杆菌的产酱香能力与其产蛋白酶活的高低有一定的相关性。

2.2.2 芽孢杆菌耐酒精生长能力测定结果

菌株LS9和S10在含不同乙醇体积分数的LB培养液中的生长状况如图1所示。由图1a和1b可知，菌株LS9和S10在乙醇体积分数为2%的培养基中，生长不受影响，但随着乙醇体积分数的提高，两种菌的生长开始受一定程度的抑制。菌株LS9和S10在乙醇体积分数为6%时仍能生长良好，培养到48h，OD600nm值可达3.0左右；但当乙醇体积分数达到8%时，两株芽孢杆菌的生长均受到明显抑制；当乙醇体积分数为10%时，菌株LS9和S10基本都不生长，结果表明，菌株LS9和S10均可耐受体积分数6%左右的乙醇。

图1 不同乙醇体积分数条件下的菌株LS9（a）及S10（b）生长曲线Fig.1 Growth curves of strain LS9(a)and S10(b)under different ethanol concentration

2.3 产酱香风味成分的分析

表4 两株芽孢杆菌发酵产香气成分检测结果Table 4 Aroma components determination results of twoBacillus strains fermentation

两株芽孢杆菌在小麦固体培养基中的产酱香发酵产物的气质分析结果见表4。由表4可知，与不接种的小麦原料空白组相比，接种菌株LS9和S10的发酵基质中有12种新的代谢产物：乙酸、5-甲基糠醛、异戊酸、苯乙醇、苯酚、2-吡咯烷酮、苯乙酸、肉豆蔻酸、十七烷酸、棕榈油酸、硬脂酸、α-亚麻酸。其中菌株LS9代谢产生的5-甲基糠醛属呋喃类物质，呋喃类物质也是报道的酱香型白酒的重要呈香物质和特征化合物[14]；2-吡咯烷酮、肉豆蔻酸和十七烷酸由菌株S10代谢产生；菌株LS9和S10的产酱香发酵实验中都有检出乙酸、异戊酸、β-苯乙醇、苯酚、苯乙酸、棕榈油酸和α-亚麻酸等物质；其中含量较高的苯乙酸可作为生产香精的原料，在菌株LS9和S10中相对含量分别为8.88%和6.65%；α-亚麻酸具有降压、抗癌、改善心脑血管疾病和预防过敏等保健功能[15]，这一物质可能成为白酒中的健康功能因子，在接种菌株LS9和S10的发酵基质中相对含量分别为3.00%和3.65%。

2.4 菌株LS9和S10发酵产乙偶姻的测定结果

将不同质量浓度的乙偶姻标准品溶液进行气相色谱测定，以峰面积为纵坐标，乙偶姻质量浓度为横坐标建立标准曲线，线性回归方程为y=6 930.5x-99 013（R2＞0.99），结果表明，乙偶姻在25～400 mg/L范围内线性关系良好。

两株芽孢杆菌发酵产乙偶姻的检测结果见表5。结果表明，菌株LS9和S10在小麦培养基中均能产生较高含量的乙偶姻，LS9在小麦培养基中经28℃恒温培养和35℃→45℃→55℃升温培养后乙偶姻含量分别为（65.15±6.15）mg/g和（41.21±3.27）mg/g，菌株S10分别为（41.33±4.82）mg/g和（26.91±2.97）mg/g，两种条件下菌株LS9的乙偶姻产量都较菌株S10高。此外菌株LS9和S10在35℃→45℃→55℃升温培养条件下代谢产生的乙偶姻含量都较28℃恒温培养条件下低，分析可能有以下两个方面的原因：一方面是28℃恒温条件下适合芽孢杆菌大量生长，乙偶姻在发酵过程中不断积累，而55℃高温对芽孢杆菌生长有一定影响，因此发酵后期乙偶姻产量有所下降；另一方面在55℃高温环境中，微生物分解蛋白质代谢产生的氨和乙偶姻开始发生反应生成了四甲基吡嗪[16]，因此乙偶姻含量有所下降。

表5 两株芽孢杆菌发酵产乙偶姻含量测定结果Table 5 Determination results of acetoin contents by twoBacillus strains fermentation

3 结论

对分离自浓酱兼香型白酒酒醅中的25株芽孢杆菌进行了碱性蛋白酶活测定，从中筛选出两株碱性蛋白酶活较高菌株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）LS9和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）S10。结果表明，菌株LS9在28℃和35℃→45℃→55℃培养条件下乙偶姻产量分别为（65.15±6.15）mg/L和（41.21±3.27）mg/L，菌株S10产量分别为（41.33±4.82）mg/L和（26.91±2.97）mg/L，两株菌均具有较好的产酱香功能和较高的产乙偶姻能力，并可耐受体积分数为6%左右的乙醇，菌株LS9和S10在28℃恒温条件下乙偶姻产量分别为（65.15±6.15）mg/L和（41.33±4.82）mg/L，较35℃→45℃→55℃升温培养条件下的乙偶姻产量高，更有利于代谢产生乙偶姻。

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Analysis of the flavor compounds fermented by sauce-flavor-producingBacillusstrain isolated from fermented grains of mixed strong-sauce-flavorBaijiu

WANG Shuang1,MIAO Lihong1*,ZHANG Mingchun2,LIU Pulin1,LIU Junchao1
(1.School of Biology and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China;2.Hubei Baiyunbian Distillery Co.,Ltd.,Songzi 434200,China)

Bacillus licheniformisLS9 andBacillus subtilisS10,with higher alkaline protease activity and ethanol tolerance were isolated from different batches of fermented grains of mixed-flavorBaijiu(Chinese liquor),the alkaline protease activityof these two strains achieved(163.82±15.85)U/ml and (241.69±20.07)U/ml during liquid-state fermentation,respectively.Both strains grew well in the medium containing ethanol 6%,and strains LS9 and S10 produced typical Moutai flavor.Results of GC-MS analysis showed that strains produced volatile compounds,including 5-methyl furfural,β-phenylethanol,phenylacetic acid,α-linolenic acid,etc.Strains LS9 and S10 had acetion-producing ability in solid wheat medium.The yield of acetoin under the condition of constant temperature of 28 ℃ were(65.15±6.15)mg/L and(41.33±4.82)mg/L,the yield of acetoin under the condition of warming culture of 35℃→45℃→55℃were(41.21±3.27)mg/L and(26.91±2.97)mg/L.

mixed flavor fermented grains;Bacillus;alkaline protease activity;flavor component

Q939.99

0254-5071（2017）10-0061-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.014

2017-04-13

湖北省重大科技创新计划项目资助（2013ABA008）

王 霜（1987-），男，硕士研究生，研究方向为酿酒微生物学。

*通讯作者：缪礼鸿（1965-），男，教授，博士，研究方向为酿酒微生物学。