以普通干酵母粉为原料的酵母抽提物制备工艺研究

崔春，赵龙，赵谋明

(华南理工大学 食品科学与工程学院，广州 510640)

以普通干酵母粉为原料的酵母抽提物制备工艺研究

崔春，赵龙，赵谋明*

(华南理工大学 食品科学与工程学院，广州 510640)

为降低酵母抽提物生产对活性酵母原料的依赖，文章以普通干酵母粉为基本原料，以蛋白回收率、水解度、转化率和干物质得率为主要指标，通过单因素试验并结合正交试验优化，最终确定了其最佳制备工艺：料液比1∶9，加酶量0.5%(E/S，胰酶∶风味蛋白酶为3∶1)，酶解时间16 h，温度55 ℃，酶解pH值8.5。在该条件下制备酵母抽提物，蛋白回收率达71.84%±0.10%，水解度为29.17%±0.12%，所测定的17种游离氨基酸总质量分数达160.21 mg/g，其中苦味氨基酸、甜味氨基酸和鲜味氨基酸分别占58.53%，20.38%和15.82%。肽分子量分析结果表明酵母抽提物中小于3 kDa的肽段质量分数高达76.68%。

酵母；酵母抽提物；酶解；分子量分布；游离氨基酸；正交试验

酵母抽提物(yeast extract，YE)，又称酵母味素、酵母精、酵母浸膏等，它主要以面包酵母或啤酒酵母为原料，在一定条件下通过酵母自溶和酶法破壁，使得菌体细胞内的蛋白质、核酸类等物质充分释放和降解，再进一步通过浓缩或干燥等处理，制备而成的膏状或粉状产品[1]，作为一种天然、绿色、健康的调味品，酵母抽提物受到广大消费者的喜爱。此外，酵母抽提物中富含多肽、氨基酸、核苷酸、维生素等众多营养物质，营养价值极高，同时其还含有一定量的谷胱甘肽，对于增强机体免疫功能有着重要意义[2]。

由于活性酵母菌菌体较为饱满，破壁难度较小，且活性酵母的自溶可起到破壁和增强风味的作用，因而目前酵母抽提物的生产均以活性酵母菌为原料[3]。然而，由于活性酵母液运输和保藏难度大，而活性干酵母成本太高，因而使得酵母抽提物的生产严重依赖于活性酵母生产线，这严重限制了酵母抽提物的发展。为此，本文以喷雾干燥后的普通干酵母粉为主要原料，以蛋白回收率、水解度和干物质得率为主要指标，在单因素试验的基础上，进一步结合正交优化试验，探讨其最佳制备工艺条件，以期降低酵母抽提物的生产对活性酵母原料的依赖。

1 材料与方法

1.1 主要材料

普通干酵母粉(活细胞率低于5%)：湛江五洲生物工程有限公司；Alcalase 2.4 L、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶：均购于诺维信(中国)生物技术有限公司；木瓜蛋白酶：购于广州华琪生物科技有限公司；胰酶：购于重庆市祥盛生物制药有限公司；三氟乙酸、甲醇：均为色谱纯；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、盐酸、硫酸等：均为分析纯。

1.2 主要试验仪器

HYP-308型八孔消化炉、KDN-103F型蛋白质测定仪 上海纤检仪器有限公司；AL204型电子分析天平 瑞士METTLER TOLEDO公司；GL-21M型高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；PHS-3E型数显pH计 上海精密科学仪器有限公司；TM840型自动电位滴定仪 法国雷迪美特(中国)有限公司；TSK-GEL G2000SWXL型分析柱 日本TOSOH东曹株式会社；Waters 600型高效液相色谱仪 美国Waters公司。

1.3 酵母抽提物的制备工艺流程

酵母抽提物的制备工艺流程见图1。

图1 酵母抽提物的制备工艺流程Fig.1 Flow chart of preparation technology of yeast extract

1.4 单因素试验方法

按1∶9的料液比将酵母粉与水混匀，分别加入质量分数为0.5%(以酵母蛋白计)的木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、Alcalase 2.4 L和胰酶，在其最适pH值、55 ℃下水解12 h，根据试验结果选取酶解效果最优的酶制剂与产物风味较好的酶制剂，再按照不同的比例进行复配试验，探讨其较佳复配比例，复配酶解条件为pH值 8.0，55 ℃，总加酶量0.5%(E/S)，酶解时间12 h。在复配试验的基础上，依次对料液比、加酶量、酶解pH值、温度和时间进行单因素优化试验。

1.5 正交试验方法

在单因素优化试验的基础上，以蛋白回收率为指标，选取加酶量、温度和酶解pH值设计三因素三水平正交试验，对酵母抽提物的制备工艺进一步进行优化。

1.6 分析测定

1.6.1 蛋白回收率的测定

采用凯氏定氮法(参照GB 5009.5-2010)测定普通干酵母粉原料与酶解离心后上清液中的总氮，则蛋白回收率(%)=(上清液总氮质量分数×上清液总质量)/(干酵母粉总氮质量分数×干酵母粉总质量)×100%。

1.6.2 干物质得率

采用常压直接干燥法(参照GB 5009.3-2010)，分别精确称取2.0000 g的上清液和普通干酵母粉原料放入105 ℃烘箱中干燥至恒重，分别测得上清液和干酵母粉原料中的干物质含量，则干物质得率(%)=(上清液干物质质量分数×上清液总质量)/(干酵母粉干物质质量分数×干酵母粉总质量)×100%。

1.6.3 水解度的测定

采用甲醛电位滴定法测定酶解离心后上清液中的游离氨态氮含量[4]，再结合干酵母粉原料的总氮，则水解度(%)=(上清液游离氨态氮质量分数×上清液总质量)/(干酵母粉总氮质量分数×干酵母粉总质量)×100%。

1.6.4 肽分子量分布的测定

取酵母抽提物稀释至蛋白浓度为4 mg/mL，采用凝胶色谱法测定其肽分子量分布情况[5]，检测条件：Waters 600高效液相色谱仪，TSK-GEL G2000SWXL色谱分析柱(批次编号：502R)，流动相配制：38 g Na2HPO4·12H2O+5.04 g NaH2PO4·2H2O+1 mL TFA 定容至1 L，检测流速1 mL/min，检测波长220 nm。标准肽样品：牛血清白蛋白(bovine serum albumin，67000 Da)，卵清蛋白 (ovalbumin，43000 Da)，细胞色素C (cytochrome C，12384 Da)，抑肽酶(aprotinin，6512 Da)，维生素B12(1355 Da)，谷胱甘肽(glutathione，307 Da)，相对分子质量的对数值与洗脱体积拟合直线方程为y=-0.4201x+7.9984(R2=0.99)，其中，y为标准肽分子量的对数；x为洗脱体积，mL。

1.6.5 游离氨基酸的测定及其呈味分析

采用A300氨基酸分析仪测定样品中的游离氨基酸[6]。取酶解后的离心上清液4 mL，加入1 mL磺基水杨酸，4 ℃下静置沉淀60 min以上，在8000 r/min下离心15 min，取上清液重复离心操作，再使用锂盐稀释液将二次离心后的上清液稀释至其氨态氮质量分数为0.008%，将稀释后的样液过0.22 μm有机滤膜并上机测定。按照不同的呈味特性对测定结果进行分类并根据文献中各类氨基酸的呈味阈值计算酶解产物中各类氨基酸的呈味强度(taste activity value, TAV)如下：

呈味强度(TAV)=氨基酸质量分数(mg/g)/氨基酸呈味阈值(mg/g)。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶的种类及其复配对酶解效果的影响

图2 酶的种类及其复配对酶解效果的影响Fig.2 Effect of different enzymes and enzyme complex on hydrolysis effect of yeast

注：a为酶的种类对酶解效果的影响，料液比 1∶9，温度55 ℃，加酶量0.5%(E/S)，酶解时间12 h；b为酶的复配对酶解效果的影响，料液比1∶9，温度55 ℃，pH值 8.0，加酶量0.5%(E/S)，酶解时间12 h。

分别采用Alcalase 2.4 L、风味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶和胰酶对普通酵母干粉进行酶解，试验结果见图2a。由图2a可知，胰酶和Alcalase 2.4 L的酶解效率较高，其中胰酶酶解的干物质得率、蛋白回收率和水解度最高，分别高达52.89%，70.12%和26.04%，风味蛋白酶酶解的干物质得率和蛋白回收率最低，仅为30.97%和36.76%，但其水解度较高，且鲜味较好，苦味较淡。分析原因主要与酶的特异性有关，胰酶和Alcalase 2.4 L作为肽链内切酶，可迅速降解大分子蛋白质的肽链生成小分子肽，此外胰酶中还含有少量的淀粉酶和脂肪酶，具有一定的脂肪酶和糖酶性质，可促进酵母的水解[7,8]。而风味蛋白酶具有外切酶的特点[9]，可从肽链末端脱除氨基酸，提高酶解产物的水解度并降低酶解产物的苦味。为此，本文选择胰酶和风味蛋白酶按照不同的比例复配对酵母进行酶解处理，试验结果见图2b。由图2b可知，胰酶与风味蛋白酶的比例为4∶1和3∶1时，干物质回收率和蛋白回收率差异不大，但胰酶与风味蛋白酶的比例为3∶1时，酵母抽提物的苦涩味较弱，鲜味和厚味较强，且随着胰酶所占比例的继续下降，酵母酶解的干物质得率和蛋白回收率逐渐下降，而鲜味和厚味改善效果减弱。综合考虑，本文选择胰酶与风味蛋白酶的比例3∶1作为两种酶的较佳复配比例进行下一步试验。

2.1.2 料液比对酶解效果的影响

图3 酶解工艺条件对酶解效果的影响Fig.3 Effect of different enzymatic hydrolysis conditions on hydrolysis effect of yeast

注：a为料液比对酶解效果的影响，胰酶与风味蛋白酶的比例 3∶1，pH值 8.0，温度55 ℃，加酶量0.5%(E/S)，酶解时间12 h；b为加酶量对酶解效果的影响，料液比 1∶9，胰酶与风味蛋白酶的比例3∶1，pH值 8.0，温度55 ℃，酶解时间12 h；c为酶解pH值对酶解效果的影响，料液比 1∶9，胰酶与风味蛋白酶的比例3∶1，温度55 ℃，加酶量0.5%(E/S)，酶解时间12 h；d为温度对酶解效果的影响，料液比 1∶9，胰酶与风味蛋白酶的比例3∶1，pH值 8.0，加酶量0.5%(E/S)，酶解时间12 h；e为时间对酶解效果的影响，料液比1∶9，胰酶与风味蛋白酶的比例3∶1，pH值 8.0，温度55 ℃，加酶量0.5%(E/S)。

料液比对酵母酶解效果的影响见图3a。由图3a可知，随着料液比的逐渐减小，酵母酶解的干物质得率、蛋白回收率和水解度均逐渐升高，且当料液比小于1∶9后其升高趋势逐渐平缓，分析原因主要是水的增多有利于酵母的分散和蛋白的溶出，对酶促反应有利，然而料液比减小易造成能耗升高，因此选择1∶9作为酵母酶解的较适料液比。

2.1.3 加酶量对酶解效果的影响

加酶量对酶解效果的影响见图3b。由图3b可知，随着加酶量的逐渐增大，酵母酶解的干物质得率、蛋白回收率和水解度均呈现升高的趋势，但在加酶量超过0.5%后，干物质得率和蛋白回收率逐渐趋于平缓，这主要是因为加酶量的增大可以增加酶与底物的接触几率，从而促进酶解。为控制生产成本，并避免酵母深度酶解后苦味过重的问题，本文选择加酶量0.5%进行下一步试验。

2.1.4 酶解pH值对酶解效果的影响

酶解pH值对酶解效果的影响见图3c。由图3c可知，随着酶解pH值的逐渐升高，干物质得率、蛋白回收率和水解度均呈现先增加后降低的趋势，且在酶解pH值为8.0时达到最高点，这主要与酶的最适作用pH值有关，试验中所用胰酶的最适作用pH值为8.0左右，风味蛋白酶的最适作用pH值为7.0左右，但由于胰酶对酵母酶解效果更为显著，因此最终酶解效果与胰酶的最适作用环境较为接近。综合考虑，本文选择pH值 8.0进行下一步试验。

2.1.5 温度对酶解效果的影响

酶解温度对酶解效果的影响见图3d。由图3d可知，随着温度的逐渐升高，酵母酶解的干物质得率和蛋白回收率均呈现先升高后降低的趋势，分别在温度为55 ℃时达到最大值59.65%和74.67%，分析原因主要是在一定范围内提高温度可以促进底物的溶出并提高酶促反应的速率，但温度过高易引起酶和底物蛋白变性[10]，因此，当温度超过其最适温度后，其干物质得率和蛋白回收率均降低，这与薛照辉等[11]的研究结果相一致。综合考虑，本文选择55 ℃进行下一步试验。

2.1.6 酶解时间对酶解效果的影响

酶解时间对酶解效果的影响见图3e。由图3e可知，随着酶解时间的延长，酵母酶解的干物质回收率、蛋白回收率和水解度均逐渐上升，但干物质得率和蛋白回收率在酶解时间超过16 h后逐渐趋于平缓，而水解度则在酶解时间超过24 h后上升速度才呈现出减慢的趋势。分析原因可能是酶解前期酵母破壁后，各类物质迅速溶出，酵母蛋白在酶的作用下迅速降解成小分子肽和氨基酸，因此干物质得率和蛋白回收率上升较快，而酶解后期酶主要作用于前期蛋白酶解所产生的多肽，因此此时干物质得率和蛋白回收率变化较小，但水解度却显著升高[12]。由于酵母深度酶解后苦味加重，且酶解液离心难度大，加工能耗较高，因此，选择16 h作为酵母酶解的较佳酶解时间。

2.2 酵母抽提物制备工艺的正交优化试验

由单因素试验结果可知，干物质得率与蛋白回收率的变化趋势基本一致，此外，水解度主要用以表述酵母蛋白在酶解过程中游离氨基酸的生成情况，该值过高易导致产物发苦，该值过低则说明酶解效果较差，正交优化试验过程中所选因素及水平应尽量避免该值过高或过低，为此，在此基础上，正交优化试验以蛋白回收率为主要指标，以实现酵母抽提物生产效益的最大化。由单因素试验可知，酵母抽提物的制备过程中加酶量、温度和酶解pH值对酶解效果影响较大，为此在料液比1∶9、胰酶∶风味蛋白酶比例3∶1、酶解时间16 h的条件下，以蛋白回收率为指标，选取加酶量、温度和酶解pH 3个变量按照表1设计三因素三水平正交试验以进一步优化酵母抽提物的制备工艺，其极差分析结果见表1。

表1 酵母抽提物制备工艺的正交优化试验及极差分析Table 1 The orthogonal experiment and range analysis of YE preparation

由表1可知，对蛋白回收率影响大小的排序为温度>加酶量>酶解pH，由k值分析可知，其最优工艺组合为A3B2C3，但考虑到加酶量为0.6%(E/S)时，酶解产物水解度较高，苦味较重，且酶解产物工业化离心分离难度大，生产成本较高，为此，在实际操作和生产中选择加酶量0.5%(E/S)。综上所述，酵母抽提物的最佳制备工艺为料液比1∶9，加酶量0.5%(E/S，胰酶∶风味蛋白酶为3∶1)，酶解时间16 h，温度55 ℃，酶解pH 8.5，在该条件下制备酵母抽提物，其蛋白回收率为71.84%±0.10%，水解度为29.17%±0.12%，产物鲜味突出，风味醇厚。

2.3 酵母抽提物的游离氨基酸含量及组成分析

在2.2节所述最佳制备工艺条件下制备酵母抽提物，采用全自动氨基酸分析仪测定其游离氨基酸含量，并计算其游离氨基酸组成，结果见表2。

表2 酵母抽提物的17种游离氨基酸含量及其呈味分析Table 2 The content and taste analysis of 17 free amino acids of yeast extract

由表2可知，酵母抽提物中17种游离氨基酸的总质量分数达160.21 mg/g(以干基计)，含量较为丰富。此外，表2中苦味氨基酸、甜味氨基酸和鲜味氨基酸的占比分别为58.53%，20.38%和15.82%[13]，这些呈味特性各异的氨基酸与其他呈味物质一起构成了酵母抽提物鲜美醇厚的风味。酵母抽提物的鲜味氨基酸主要由谷氨酸组成，其占比为12.17%，呈味强度为64.98；甜味氨基酸主要由丙氨酸组成，其占比为11.01%，呈味强度为29.41；苦味氨基酸主要由苯丙氨酸、赖氨酸和亮氨酸组成，其中以赖氨酸的呈味强度最高，高达63.60。这在一定程度上证实了游离氨基酸对酵母抽提物呈味特性的贡献，然而，通过对酵母抽提物稀释液(固形物质量分数0.5%)的进一步感官品评，发现在各种氨基酸含量均远低于其阈值的情况下，样品依然存在较强的鲜甜味，这充分说明酵母抽提物的呈味特性与其呈味肽紧密相关。尽管酵母抽提物中苦味氨基酸含量较高，但感官品评过程中其苦味较淡，分析原因可能是风味蛋白酶在酶解过程中脱除了肽链末端的疏水性氨基酸，从而增大了游离氨基酸中苦味氨基酸的含量和组成占比，但与此同时降低了酶解产物的苦味。

2.4 酵母抽提物的肽分子量分布情况

在2.2节所述最佳制备工艺条件下制备酵母抽提物，测定其肽分子量分布，结果见图4。

图4 酵母抽提物的肽分子量分布Fig.4 The molecular weight distribution of peptides of yeast extract

由图4可知，酵母蛋白在胰酶和风味蛋白酶的复合酶解作用下降解成不同分子量的肽段，且其分子量主要集中分布在5 kDa以下，其中小于3 kDa的肽段质量分数高达76.68%，这说明酵母蛋白酶解较为充分，结合表2可知，酵母抽提物的滋味特性来源可能主要与其所拥有的小分子肽有关。

3 结论

以普通干酵母粉为主要原料，通过单因素试验并结合正交试验方法优化并确定了酵母抽提物的最佳制备工艺条件：料液比1∶9，加酶量0.5%(E/S，胰酶∶风味蛋白酶为3∶1)，酶解时间16 h，温度55 ℃，酶解pH 8.5，在该条件下制备酵母抽提物，其蛋白回收率为71.84%±0.10%，水解度为29.17%±0.12%，所测定的17种游离氨基酸总含量高达160.21 mg/g(以干重计)，其中苦味氨基酸、甜味氨基酸和鲜味氨基酸分别占58.53%，20.38%和15.82%。肽分子量分析结果表明酵母抽提物中小于3 kDa的肽段质量分数高达76.68%，这些呈味特性各异的氨基酸、小分子肽类和其他呈味物质一起构成了鲜美醇厚的呈味特性。

[1]In M J,Kim D C,Chae H J.Downstream process for the production of yeast extract using brewer's yeast cells[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering,2005,10(1):85-90.

[2]罗依雨,罗维,刘峻熙,等.啤酒废酵母自溶提取物的制备及抗氧化活性研究[J].华南师范大学学报自然科学版,2016,48(1):89-93.

[3]刘杰.高品质生化培养基用酵母抽提物制备的研究[D].广州:华南理工大学,2011.

[4]Rutherfurd S M.Methodology for determining degree of hydrolysis of proteins in hydrolysates: a review[J].Journal of AOAC International,2010,93(5):1515-1522.

[5]Su Guowan,Ren Jiaoyan,Zhao Mouming,et al.Comparison of superdex peptide HR 10/30 column and TSK gel G2000 SWXL column for molecular weight distribution analysis of protein hydrolysates[J].Food & Bioprocess Technology,2013,6(12):3620-3626.

[6]Zeng Yihang,Cai Wensheng,Shao Xueguang.Quantitative analysis of 17 amino acids in tobacco leaves using an amino acid analyzer and chemometric resolution[J].Journal of Separation Science,2015,38(12):2053.

[7]Gu Mu,Chen Huiping,Zhao Mouming,et al.Identification of antioxidant peptides released from defatted walnut (JuglansSigillataDode) meal proteins with pancreatin[J].LWT-Food Science and Technology,2015,60(1):213-220.

[8]Lei Fenfen,Zhao Qiangzhong,Sun-Waterhouse Dongxiao,et al.Characterization of a salt-tolerant aminopeptidase from marineBacilluslicheniformisSWJS33 that improves hydrolysis and debittering efficiency for soy protein isolate[J].Food Chemistry,2017,214:347-353.

[9]Mayjune Tsou.Enhancing the anti-adipogenic activity of soy protein by limited hydrolysis with flavourzyme and ultrafiltration[J].Food Chemistry,2010,122(1):243-248.

[10]Deng J C.Effect of temperatures on fish alkaline protease,protein interaction and texture quality[J].Journal of Food Science,2006,46(1):62-65.

[11]薛照辉,石颖娜,李勇,等.碱性蛋白酶(alcalase)水解鹰嘴豆分离蛋白的工艺优化[J].中国粮油学报,2008,23(5):75-79.

[12]Ovissipour M,Abedian A,Motamedzadegan A,et al.The effect of enzymatic hydrolysis time and temperature on the properties of protein hydrolysates from Persian sturgeon (Acipenserpersicus) viscera[J].Food Chemistry,2009,115(1):238-242.

[13]Ardö Ylva.Flavor formation by amino acid catabolism[J].Biotechnology Advances,2006,24(2):238-242.

PreparationofYeastExtractwithCommonDryYeast

CUI Chun, ZHAO Long, ZHAO Mou-ming*

(School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

Since the preparation of YE with active yeast as raw material has caused a serious dependence on the resource of active yeast accompanied with a high cost for the raw material, the preparation of YE with common dry yeast is investigated in this paper. The enzyme complex, ratio of material to water, enzyme amount, hydrolysis time, hydrolysis temperature and pH value during preparation of YE are optimized through the determination of protein recovery, dry matter recovery,conversion rare and degree of hydrolysis. The orthogonal experiment is designed to further optimize the amount of enzyme complex, hydrolysis temperature and pH value to find the best processing technology for YE preparation with common dry yeast. The results show that the best process parameters are as follows: the ratio of material to water is 1∶9, the amount of enzyme is 0.5% (E/S, ratio of trypsin to flavourzyme is 3∶1), the hydrolysis time is 16 h, the hydrolysis temperature is 55 ℃, and the pH value is 8.5.The protein recovery of YE prepared under the best process parameters could reach 71.84%±0.10%, the degree of hydrolysis is 29.17%±0.12%.The total mass fraction of 17 kinds of free amino acids is 160.21 mg/g. The free amino acids analysis shows that the amino acids with bitterness account for 58.53%, the amino acids with sweetness account for 20.38% and the amino acids with umami account for 15.82%. The molecular weight distribution of peptides shows that the mass fraction of peptides less than 3 kDa in yeast extract reaches up to 76.68%.

yeast;yeast extract;enzymatic hydrolysis;molecular weight distribution;free amino acids;orthogonal experiment

TS201.1

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.11.001

1000-9973(2017)11-0001-06

2017-05-16 *通讯作者

国家高技术研究发展计划(863计划)(2013AA102201)；广东省战略性新兴产业核心技术攻关(2012A080800014，2012A020800002)；广州市科技计划项目(201604020067)

崔春(1978-)，男，湖北洪湖人，教授，博士，研究方向：食品生物技术；

赵谋明(1964-)，男，湖南益阳人，教授，博士，研究方向：食品生物技术。