新、陈大蒜提取物抑菌活性的研究

孟君，彭秀丽，庄勤，罗立强

(1.郑州轻工业学院 食品与生物工程学院，郑州 450002；2.食品生产与安全河南省协同创新中心，郑州 450002；3.郑州铁路职业技术学院 药学系，郑州 451460；4.上海大学 化学系，上海 200444)

新、陈大蒜提取物抑菌活性的研究

孟君1，2，彭秀丽3，庄勤1，罗立强4

(1.郑州轻工业学院 食品与生物工程学院，郑州 450002；2.食品生产与安全河南省协同创新中心，郑州 450002；3.郑州铁路职业技术学院 药学系，郑州 451460；4.上海大学 化学系，上海 200444)

以新鲜、陈2种大蒜为材料，95%乙醇为提取剂，浸提大蒜研磨液，以3种常见细菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌为供试菌，用牛津杯法比较大蒜提取液对3种常见细菌的抑菌活性。结果表明：2种大蒜提取液对3种菌的生长均有较好的抑制作用，但抑制作用不同，2种浸提液抑制效果依次是：金黄色葡萄球菌>大肠杆菌>枯草芽孢杆菌，新鲜大蒜提取物的抑菌效果更佳。采用气相色谱-质谱分析大蒜提取物的挥发性主要化学成分，分析结果表明新鲜大蒜提取液中的主要挥发性有机成分有46种；陈大蒜提取液中的主要挥发性有机成分有54种。其中2种大蒜提取物的主要抑菌活性成分，含硫的化合物二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚的相对含量，在新大蒜中分别为5.336%，0.541%，在陈大蒜中分别为4.126%， 0.791%。

大蒜；大蒜提取物；牛津杯法；抑菌活性；化学成分

大蒜(Alliumsatium)是百合科葱属多年生草本植物，在亚洲许多国家及其他地区是一种常用的烹饪调味品及健康食品，在我国种植面积广泛[1,2]。其味道辛辣，能助消化，增加食欲，对预防疾病有很好的作用。大蒜具有多种功能，对不同的病毒、细菌、真菌等病原微生物有很大程度的抑制消灭作用，同时能预防及抑制癌症肿瘤的生长，被广泛地称为“天然抗生素”[3-5]。大蒜中富含多种营养成分和有效的生物活性成分，大蒜提取物是大蒜重要的生物活性物质，挥发性含硫化合物是其主要生物活性成分[6,7]，其中二烯丙基三硫化物和二烯丙基二硫化物含量最丰富，具有强烈的抗菌消炎作用[8-10]。在回归自然、天然绿色的国际食品潮流中，研究无副作用、对生活中常见细菌生长的抑制作用、探讨作用与成分的内在关系，具有十分重要的意义。本研究以刚采收的新鲜大蒜和陈大蒜为材料，以95%乙醇为提取剂，浸提2种大蒜研磨液提取大蒜成分，并对提取液的成分进行了活性和成分分析，为进一步分离大蒜有效挥发活性成分和开发天然高效的抑菌物质研究提供参考依据。

1 实验材料与仪器

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

新鲜大蒜和陈蒜：购于郑州市农贸市场；

标准菌株：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，由郑州轻工业学院食工学院实验室提供。

1.1.2 主要试剂

无水乙醇、无水硫酸钠、氢氧化钠、氯化钠均为分析纯；吐温80(CP)；酵母浸粉、牛肉浸膏、蛋白胨、琼脂均为生物试剂。

1.2 主要仪器

DHG-9145A电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；HH-S4数显恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；LX-C35高压蒸汽灭菌锅 合肥华泰医疗设备有限公司；SW-CJ-IFD超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；SHP-250智能生化培养箱 上海鸿都电子科技有限公司；JY1001电子天平 上海浦春计量仪器有限公司；GC6890-5973MS气相色谱-质谱联用仪(配有G1701MSD化学工作站、全自动进样器和Nist 11标准谱库) 美国安捷伦科技有限公司；TD5A-WS台式离心机 湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 大蒜成分提取

新鲜大蒜和陈蒜去皮，洗净晾干，分别称50 g新鲜蒜和陈蒜，室温下自然酶解0.5 h后，加入95%的酒精200 mL，室温状态下萃取2 h，以3000 r/min的转速离心15 min，取上清液于烧杯中，转入旋转蒸发仪的圆底烧瓶中，控制温度在50 ℃，转速50 r/min，进行浓缩得浓缩的大蒜素原液(浓度为1 g/mL)，用微孔滤膜过滤，过滤后的原液放于灭过菌的离心管中，用报纸包着避光，置于4 ℃冰箱条件下保存备用。

1.3.2 菌悬液制备

将3种标准菌株：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌用平板划线法无菌操作接种到琼脂平板上，置于37 ℃培养箱中培养24 h，得到活化的菌落，取适量菌落放于盛有无菌水的试管中，振荡均匀得菌悬液，在无菌条件下，将菌悬液的浓度控制在10-6，10-8cfu/mL，制备好的细菌悬浮液密封，4 ℃冰箱保存备用。

1.3.3 含菌平板的制备

无菌环境下，用移液枪分别吸取上述制备的3种标准菌株菌悬液各0.2 mL于灭菌的直径9 cm培养皿中，将灭菌好的营养琼脂培养基放置至温度约为50 ℃，分别倒入无菌的培养皿内(每皿约15 mL )，轻轻晃动使其混合均匀，平面上冷却凝固后进行抑菌试验。

1.3.4 抑菌效果试验

采用牛津杯法，将提前灭好菌的牛津杯，用无菌镊子夹取，轻轻均匀垂直地放于凝固含菌培养基上，每个平板内等距离放2个牛津杯，分别加入0.15 mL提取的新旧大蒜素原液，同时用95%的乙醇溶液作对照液的试验，依次将做好标记的各培养皿，轻轻置于恒温培养箱(37 ℃)中培养24 h。移动过程中保持牛津杯位置不变，里面的大蒜原液不能外溅流出，平行3皿，重复试验3次，结果取各次测定平均值。

1.3.5 抑菌条件的选择

1.3.5.1 大蒜浓度对抑菌作用的影响

分别取3 mL 2种大蒜原液于灭过菌的干净试管中，采用二倍稀释法，将10%(体积分数)的吐温80 进行梯度稀释，制成浓度为 1∶1，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64系列的稀释液，分别加入0.15 mL系列浓度的大蒜提取液与制备的3种细菌平板上，依次做好标记，各培养皿轻轻置于恒温培养箱(37 ℃)培养24 h。移动过程中保持牛津杯位置不变，里面的大蒜原液不能外溅流出，平行3皿，重复试验3次，取平均值作为测定结果。

1.3.5.2 温度对大蒜抑菌作用的影响

分别取3 mL 2种大蒜素原液分装在5个无菌试管中，水浴锅的温度调为15，30，45，60，75，90 ℃，将试管放入，1 h后进行抑菌效果试验，将提前灭好菌的牛津杯用无菌镊子夹取，轻轻均匀垂直地放于凝固含菌培养基上，每个平板内等距离放2个牛津杯，分别加入0.15 mL经过相同温度处理的2种新旧大蒜素原液，操作同上。

1.3.5.3 pH对大蒜抑菌作用的影响

分别取3 mL 2种大蒜素原液于5个无菌试管中，分别将其pH值调到4.0，5.0，6.0，7.0，8.0后，静置平衡10 h之后，进行大蒜的抑菌效果试验，分别加入0.15 mL经过相同pH处理的2种新旧大蒜素原液，培养操作同上，做好标记，取平均值作为测定结果。

1.3.5.4 最佳条件实验

综合上述各条件下的抑菌结果，得出2种大蒜素原液的最佳抑菌条件，在最佳条件下进行大蒜的抑菌活性实验，从而得出最佳条件下2种大蒜对3种菌的抑菌活性大小。

1.3.6 大蒜液GC-MS分析

取适量上述制备的2种大蒜提取液，分别放于试管中，加入适量的无水硫酸钠，放置过夜后，以无水硫酸钠不结块为宜，过滤，取适量干燥过滤后的大蒜液，用GC-MS分析大蒜素原液中挥发性的有机成分。

1.3.6.1 GC条件

柱子类型：HP-5MS(60 m×250 μm,0.25 μm)；升温程序：50 ℃保持3 min，以4 ℃/min升至280 ℃，保持10 min；进样口温度260 ℃；载气为高纯(99.99%)氦气；柱流速1.0 mL/min，传输线温度270 ℃；分流比5∶1；进样体积1 μL；溶剂延迟时间6 min。

1.3.6.2 MS条件

用电子轰击(EI)源分析，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，接口温度280 ℃，选用全扫描(SCAN)模式，质量扫描范围35～550 amu，对采集到的质谱图利用Nist 11谱库进行检索。

2 结果与讨论

2.1 2种大蒜提取物对3种菌的抑制作用

2种大蒜提取物对3种菌的抑制作用的平板实验结果见图1～图3。

图1 两种大蒜提取液对大肠杆菌的抑菌作用

注：左为新鲜大蒜，右为陈大蒜。

图2 两种大蒜提取液对枯草芽孢杆菌的抑菌作用

注：左为新鲜大蒜，右为陈大蒜。

图3 两种大蒜提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用

注：左为新鲜大蒜，右为陈大蒜。

2.1.1 牛津杯法测定2种大蒜提取液抑菌效果

采用牛津杯法测定2种大蒜提取液对3种菌的抑菌效果，见表1。

表1 大蒜提取液的抑菌活性 cm

由表1抑菌圈的直径大小可知，同种条件下，新鲜大蒜提取液对3种试验细菌的抑菌效果明显好于陈大蒜提取液对3种试验细菌的抑菌效果对照加入95%乙醇无抑菌圈出现。2种大蒜提取液对3种菌的抑制大小依次是：金黄色葡萄球菌>大肠杆菌>枯草芽孢杆菌。

2.1.2 新陈2种大蒜提取液浓度对抑菌作用的影响

表2 大蒜提取液的最小抑菌浓度(MIC) mg/mL

由表2可知，新鲜大蒜提取液对3种供试菌的抑菌作用不同，最小抑菌浓度分别为：金黄色葡萄球菌7.813 mg/mL、大肠杆菌15.625 mg/mL、枯草芽孢杆菌31.250 mg/mL，而陈大蒜对3种菌的抑制作用相同，3种细菌的最小抑菌浓度均为15.625 mg/mL。

2.1.3 温度对抑菌效果的影响

表3 温度改变对新鲜大蒜的抑菌效果(cm)

由表3可知，新陈2种大蒜提取液对3种细菌的抑菌效果受温度的影响， 在30 ℃时，3种菌的抑菌圈直径最大，随着温度的升高，抑菌圈直径变小，当温度达到90 ℃时，抑菌圈直径明显减小，实验结果表明随温度的升高，大蒜抑菌效果减弱。

2.1.4 pH对新旧大蒜的抑菌效果

表4 pH改变对新陈大蒜的抑菌效果(cm)

由表4可知，pH在4～7之间的抑菌圈直径变化不大，2种大蒜提取液的pH为6时，3种菌的抑制效果都最好。当pH>7时，抑菌圈明显减小，说明大蒜提取液在酸性条件下对3种试验菌的抑制作用较好。

2.2 2种大蒜成分分析

对新鲜大蒜和陈大蒜样品乙醇提取液在1.3.6选定的测定条件下进行分析，总离子流图分别见图4和图5。根据峰面积大小，经数据库检索，初步分离检测出新鲜大蒜中46种主要成分，见表5；按峰面积大小，初步分离陈大蒜中54种主要成分，见表6。

图4 新鲜大蒜的离子流图

图5 陈大蒜的离子流图

序号保留时间(min)百分比比配度化合物18．2460．1390吡啶210．9690．229932⁃甲基吡啶311．3180．357802⁃甲基吡嗪411．8052．81987呋喃甲醛512．9122．40194糠醇613．2140．74264二烯丙基硫醚713．4630．327914⁃甲基吡啶814．4750．192644⁃环戊烯⁃1，3⁃二酮915．9920．511642，6⁃二甲基吡嗪1016．1040．499383，4⁃二氢⁃2H⁃吡喃1216．70．563641，2⁃环戊二酮1317．7950．368431，3⁃二噻烷1418．390．315915⁃甲基⁃2⁃呋喃甲醇1518．7190．202943⁃乙基吡啶1619．021．32945⁃甲基呋喃醛1719．7590．41883二甲基三硫1823．9641．444942⁃苯基乙醛1924．3541．908784⁃羟基⁃2，5⁃二甲基⁃3(2H)呋喃酮2024．7990．205722⁃呋喃甲酸

续 表

注：*在本表中显示的是比配度大于38的数据。

由表5可知，新鲜大蒜提取液的化学成分种类丰富，主要含有酮、醛、酸、酯、烯、烷、醚等，相对含量最高的是5-羟甲基糠醛，百分比为8.585%；其次为主要抑菌成分二烯丙基二硫醚，百分比为5.336%，起抑菌作用的二烯丙基三硫醚，百分比为0.541%。

表6 陈大蒜提取物中主要挥发性成分及相对含量

续 表

注：*在本表中显示的是比配度大于38的数据。

由表6可知，陈大蒜的成分比新鲜大蒜的成分还要复杂，鉴定出的主要化学成分达54种，分别是酮、醛、酸、酯、烯、烷、醚等，含量最高的也是5-羟甲基糠醛，相对百分比含量为12.443%，较新鲜大蒜高3.858%；其次为3-乙烯基-1,2-二硫环己-4-烯，百分比为5.101%，与新鲜大蒜相当；主要抑菌成分：二烯丙基二硫醚，相对含量为4.126%，比新鲜大蒜低1.210%，二烯丙基三硫醚的百分含量为0.791%。

3 结论

本文研究了2种大蒜提取液对3种常见细菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌作用，结果表明、大蒜提取液对3种试验菌都有较好的抑菌效果，新、陈大蒜对金黄色葡萄球菌的生长抑制作用相对较好，对枯草芽孢杆菌的生长抑制相对较弱，其中新鲜大蒜提取液抑菌效果更佳。

2种大蒜提取液，大蒜的抑菌效果，随温度的改变抑菌效果有明显改变，温度升高，抑菌效果逐渐减弱，温度在30℃的抑菌效果最佳，当温度达到90℃时，抑菌效果明显小于30℃的抑菌效果。这与刘天贵[11]的观点大蒜经高温(100～121℃)处理后，蒜素会受热分解，从而失去其原本的杀菌作用结果相符，所以大蒜尽量生吃，才能更好地发挥它的作用。

2种大蒜提取液的抑菌活性，受pH值影响， pH在4～7的抑菌圈直径变化不大， 在pH为6时，抑制效果最好，说明在酸性条件下，大蒜提取液对3种试验菌有较好的抑制作用。

通过GC-MS分析，大蒜乙醇萃取物中，种类丰富，化学成分复杂，主要的挥发性化学成分，新鲜大蒜提取物中有46种，陈大蒜提取物中有54种，其中含有较为丰富的抑制各种细菌及其他微生物生长的有效成分的含硫化合物，二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚，比较2种大蒜成分的相对含量可知，新大蒜中含硫化合物的百分含量较陈大蒜的高，这与所做试验的抑菌效果结果相符。

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ResearchonBacteriostaticActivityofFreshandAgedGarlicExtract

MENG Jun1, PENG Xiu-li3, ZHUANG Qin1, LUO Li-qiang4

(1.School of Food and Bioengineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou 450002, China；2.Collaborative Innovation Center of Food Production and Safety,Henan Province,Zhengzhou 450002, China；3.Depatment of Phamacy,Zhengzhou Railway Vocational & Technical College,Zhengzhou 451460, China;4.Department of Chemistry,Shanghai University, Shanghai 200444, China)

Select fresh and aged garlics as raw materials,use 95% ethanol as extractant，extracting grinding fluid of garlic,different ethanol extracts of garlic are evaluated by Oxford cup method to discuss the antibacterial activity of three common bacteria such asEscherichiacoli,Staphylococcusaureus,Bacillussubtilis, which are considered as testing bacteria. The results show that the two kinds of garlic extracts all have better inhibition on the growth of the three kinds of bacteria, but the inhibition effects are different. The inhibition effect is in the order ofStaphylococcusaureus>Escherichiacoli>Bacillussubtilis. Comparing the two kinds of garlic extracts, fresh garlic has better bacteriostatic effect than the aged garlic.The main volatile chemical components of garlic extract are analyzed by using gas chromatography-mass spectrometry to analyze two kinds of garlic extract ingredients.The results show that fresh garlic extract has 46 kinds of main volatile organic compounds, aged garlic extract has 54 volatile organic compounds. Two kinds of bacteriostatic active ingredients in garlic extract， sulfur-containing compounds, diallyl disulfide has 5.336% in fresh garlic, 4.126% in aged garlic and diallyl trisulfide has 0.541% in fresh garlic, 0.791% in aged garlic.

garlic;garlic extract;Oxford cup method;bacteriostatic activity;chemical component

TS264.29

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.11.007

1000-9973(2017)11-0035-05

2017-06-15

国家自然科学基金资助项目(31271854)

孟君(1971-)，女，教授，研究方向：仪器与食品分析。