分子诊断在结直肠癌术后治疗中的应用

刘志强，李守淼，张 伟，张志忠，王雁军，李保中(.安阳市肿瘤医院外一科，河南 安阳 455000；.安阳市肿瘤医院外四科，河南 安阳 455000)

分子诊断在结直肠癌术后治疗中的应用

刘志强1，李守淼1，张 伟1，张志忠1，王雁军2，李保中1
(1.安阳市肿瘤医院外一科，河南 安阳 455000；2.安阳市肿瘤医院外四科，河南 安阳 455000)

目的探讨分子诊断在结直肠癌术后治疗中的应用及其意义。方法回顾性分析34例结直肠癌患者的临床病理资料，检测DNA切除修复交叉互补基因1(ERCC1)mRNA、胸苷酸合成酶(TYMS)mRNA水平以及二氢嘧啶脱氢酶(DPYD)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)基因多态性。结果ERCC1、TYMS mRNA高表达分别占67.6%、52.9%，其中ERCC1 mRNA表达水平与淋巴结转移数目呈负相关。DPYD、UGT1A1突变率分别为26.0%、30.4%，UGT1A1突变率与肿瘤肿瘤分化程度成负相关。结论分子诊断在结直肠癌术后治疗方案选择中具有重要指导意义。

结直肠癌；分子诊断；药物敏感性；不良反应；预测转移

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，近几年发病率居高不下，全球每年新发病例超过100万例[1]，2008年WHO数据[2]提示北美结直肠患者5 a生存率61%，而我国结直肠患者总体5 a生存率仅为32%，远远低于北美水平。虽然我国外科手术技术已与国际水平基本同步，但是较大差异的生存情况提示结直肠癌的综合治疗仍然存在较大差距。结直肠癌治疗随着研究的深入已经达到分子水平，不同分子分型、遗传背景导致不同的预后，因此如何检测肿瘤分子类型、选择合适的治疗方法已经成为治疗不同患者的关键。该研究通过检测肿瘤基因表达情况来指导术后用药，以期达到精确、有效治疗。

1 资料与方法

1.1一般资料回顾性分析2012年11月至2013年4月在安阳市肿瘤医院接受手术治疗后行分子检测的34例结直肠癌患者的临床病理资料，检测肿瘤组织中DNA切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-complementing, group 1，ERCC1)mRNA、胸苷酸合成酶(thymidylate synthetase，TYMS)mRNA水平,检测外周血二氢嘧啶脱氢酶(dihydropyrimidine dehydrogenase gene，DPYD)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(uridine diphosphoglucu-ronosyl transferase 1A1,UGTlA1)基因多态性。

1.2检测方法基因表达水平采用分支DNA-液相芯片法，基因多态性检测使用xTAG-液相芯片法。

1.3统计学处理采用SPSS 19.0处理相关数据，计数资料用百分数表示，比较用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1患者一般资料34例结直肠癌患者均未行术前放、化疗，其中男22例，女12例；年龄27～84(56±14)岁；病程3～1 080(156±223)d；肿瘤最大直径1～12(5.2±2.6)cm；结肠癌14例，直肠癌20例；TNM分期:Ⅱ期15例，Ⅲ期14例，Ⅳ期5例。

2.2ERCC1、TYMS、DPYD、UGT1A1与患者临床病理资料的关系ERCC1、TYMS mRNA高表达分别占67.6%、52.9%，ERCC1 mRNA表达水平与淋巴结转移数目呈负相关(P=0.003)，而与年龄、病程、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度、器官侵犯、病理类型、TNM分期无明显相关(P>0.05)，TYMS mRNA表达水平与年龄、病程、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移数目、器官侵犯、病理类型、TNM分期无明显相关(P>0.05)。DPYD、UGT1A1突变率分别为26.0%、30.4%，UGT1A1突变率与肿瘤肿瘤分化程度成负相关(P=0.008)。见表1、2。

3 讨论

结直肠癌根治性切除是提高术后生存率、改善预后的关键，是目前惟一可以治愈结直肠癌的方法，1982年Heald等[3]提出全直肠系膜切除术(total mesorectal excision TME)，显著减少了直肠癌术后复发，提高了长期生存，从而确立了TME作为直肠癌根治标准术式的地位，遵循这种组织胚胎学的解剖理念， Hohenberger等[4]提出了全结肠系膜切除术在结肠癌根治术，为结肠癌根治术提供了一种新的思路，具体效果有待进一步临床验证。随着现代科技的发展，腔镜技术发展迅猛，但不论是开放手术还是腔镜手术，结直肠癌根治术的原则是一致的。但是同样的手术方式，结直肠癌患者生存情况在国内与北美存在明显差异，这种差异与采取不同综合治疗方法有关。乳腺癌治疗模式的成功为其他肿瘤治疗提供了新的思路，结直肠癌不应该只看到局部，而应该是全身性疾病，术后综合治疗明显改善了预后，但是临床结局证明并不是每例患者都能从综合治疗中获益，甚至严重的不良反应可能造成不可逆转的后果，因此结直肠癌综合治疗的个体化选择显得非常重要，然而如何既能达到最佳疗效又能将不良反应降到最低是一个艰难的选择，如何达到这种平衡困扰着临床医生。生物科技的发展为分子诊断提供了有效的工具，目前结直肠癌辅助化疗标准方案为奥沙利铂联合氟尿嘧啶类药物，而含伊立替康和奥沙利铂的两药方案是转移性结直肠癌的一线方案，随着经济的发展，越来越多靶向治疗开始在结直肠治疗中扮演较多的角色，为此本研究针对这几类药物筛选检测相关基因，直接为化疗药物敏感性、药物不良反应、靶向药物的有效性提供了相对科学的依据。

表1 ERCC1、TYMS mRNA水平与患者临床病理资料的关系

表2 DPYD/UGT1A1基因多态性与临床资料关系

ERCC1的表达水平直接影响DNA修复的生理过程。临床研究已证实ERCC1参与铂类化疗药物耐药性的发生，其表达水平与多种恶性肿瘤铂类化疗疗效和生存期呈负相关[5-7]。本研究提示ERCC1高表达占67.6%，2/3的患者在常规剂量铂类药物不能获益，2010年NCCN临床实践指南明确指出：在接受铂类化疗前进行ERCC1 mRNA表达水平检测可提高治疗有效率和患者生存率[8]。ERCC1 mRNA表达水平随着淋巴结转移增多表达增高，临床上淋巴结转移越多预后越差，化疗效果越差，但是具体机制还需进一步研究。TYMS基因编码的胸苷酸合成酶是嘧啶核苷酸合成的限速酶，是肿瘤生长的重要因子，也是5-氟尿嘧啶发挥化疗作用的主要靶点。5-氟尿嘧啶的代谢物与TYMS结合，阻碍其正常功能，从而抑制DNA的合成。在结直肠癌中TYMS mRNA表达水平与5-氟尿嘧啶疗效呈负相关[9]。本研究提示52.9%的患者不能在常规剂量5-氟尿嘧啶治疗下获益，若想获得理想疗效需要提高剂量。盲目提高用药剂量对患者可能产生难以挽救的损伤，因此，不仅要选择合适的剂量又要避免较重的不良反应。DPD由DPYD编码，与5-氟尿嘧啶的降解有关。DPYD基因发生突变后，会降低该酶的活性，增加氟类药物的不良反应。含伊立替康和奥沙利铂的两药化疗方案是转移性结直肠癌标准的一线化疗方案，但是联合用药难免要付出更多的不良反应代价，因此，检测伊立替康药物不良反应也显得尤为重要。伊立替康在体内代谢为7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)，SN-38的活性比伊立替康强100到1 000倍。UGT1A1可以使SN-38葡萄糖醛苷化而被灭活，因此降低伊立替康的不良反应。UGT1A1的酶活性与其基因多态性相关，UGT1A1基因突变会降低该酶的活性，增加伊立替康的不良反应[10-12]。本研究结果提示UGT1A1基因多态性与肿瘤分化程度有关，随着肿瘤分化程度增高UGT1A1突变率降低，但临床不能因为肿瘤分化程度低而冒险增大伊立替康用药量。K-RAS基因突变与结直肠癌的发生、发展有着密切的联系，影响了肿瘤细胞的生存、增殖、迁移、扩散、血管生成，K-RAS是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)下游重要分子，因此K-RAS的突变成为靶向治疗的关键。研究[13-15]发现，肿瘤患者对吉非替尼、厄洛替尼和西妥昔单抗等靶向治疗药物的原发性耐药与K-RAS外显子2第12和13位密码子的突变有关。2010年NCCN中明确指出：肿瘤患者接受EGFR靶向药物治疗之前，必须进行K-RAS基因突变检测，根据检测结果决定是否使用EGFR靶向药物作为临床治疗措施[8]。最近有研究[16-17]表明，携带p.G13D突变的转移性结直肠癌患者能从一线西妥昔单抗联合化疗治疗中获益，获益程度与K-RAS野生型患者相仿。限于靶向治疗费用昂贵，此类药物的检测受到一定限制。循环肿瘤细胞的检测是临床检验的一次革命，其在乳腺癌中的应用引起了广泛注意，2009年被应用于结直肠癌检测，在术前分期、术后治疗效果评定中具有重要指导意义[17-19]。

人类基因组计划的完成，为研究个体之间基因的差异性以及这种差异如何影响不同个体对疾病的敏感性及对药物的反应性创造了条件，液相芯片技术兴起于20世纪90年代，是一种集合流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及传统芯片技术为一体的新型生物检测技术，被誉为后基因组时代的芯片技术。本研究采用这一先进技术发现ERCC1、TYMS mRNA高表达占据较大比例，这也就解释了不同结直肠癌患者综合治疗效果不同的现象，但是目前本研究样本量较少，分子诊断在临床治疗方案选择中的指导意义还待进一步确定。

[1] JEMAL A, SIEGEL R, WARD E, et al.Cancer statistics, 2009[J].CA Cancer J Clin, 2009，59(4):225-249.

[2] COLEMAN MP, QUARESMA M, BERRINO F, et al.Cancer survival in five continents: a worldwide population-based study (CONCORD) [J].Lancet Oncol, 2008，9(8):730-756.

[3] HEALD RJ, HUSBAND EM, RYALL RD.The mesorectum in rectal cancer surgery--the clue to pelvic recurrence[J].Br J Surg, 1982，69(10):613-616.

[4] HOHENBERGER W, WEBER K, MATZEL K, et al.Standardized surgery for colonic cancer: complete mesocolic excision and central ligation--technical notes and outcome[J].Colorectal Dis, 2009，11(4):354-364.

[5] BEPLER G,KUSMARTSEVA I,SHARMA S,et al.RRM1 modulated in vitro and in vivo efficacy of gemcitabine and platinum in non-small-cell lung cancer[J].J Clin Oncol,2006,24(29):4731-4737.

[6] OLAUSSEN KA, DUNANT A, FOURET P, et al.DNA repair by ERCC1 in non-small-cell lung cancer and cisplatin-based adjuvant chemotherapy[J].N Engl J Med, 2006，355(10):983-991.

[7] LORD RV, BRABENDER J, GANDARA D, et al.Low ERCC1 expression correlates with prolonged survival after cisplatin plus gemcitabine chemotherapy in non-small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res, 2002，8(7):2286-2291.

[8] 陈绍俊,吴梦馨,韦晓谋,等.ERCC1 mRNA表达水平与Ⅱ期鼻咽癌顺铂同步放化疗疗效相关性的临床研究[J].肿瘤基础与临床，2016,29(5)：373-376.

[9] SHIROTA Y, STOEHLMACHER J, BRABENDER J, et al.ERCC1 and thymidylate synthase mRNA levels predict survival for colorectal cancer patients receiving combination oxaliplatin and fluorouracil chemotherapy[J].J Clin Oncol, 2001,19(23):4298-4304.

[10] INNOCENTI F, UNDEVIA SD, IYER L, et al.Genetic variants in the UDP-glucuronosyltransferase 1A1 gene predict the risk of severe neutropenia of irinotecan[J].J Clin Oncol, 2004,22(8):1382-1388.

[12] YAMAMOTO N, TAKAHASHI T, KUNIKANE H, et al.Phase Ⅰ/Ⅱ pharmacokinetic and pharmacogenomic study of UGT1A1 polymorphism in elderly patients with advanced non-small cell lung cancer treated with irinotecan[J].Clin Pharmacol Ther, 2009，85(2):149-154.

[13] VAN ZANDWIJK N, MATHY A, BOERRIGTER L, et al.EGFR and KRAS mutations as criteria for treatment with tyrosine kinase inhibitors: retro- and prospective observations in non-small-cell lung cancer[J].Ann Oncol, 2007,18(1):99-103.

[14] DE ROOCK W, PIESSEVAUX H, DE SCHUTTER J, et al.KRAS wild-type state predicts survival and is associated to early radiological response in metastatic colorectal cancer treated with cetuximab[J].Ann Oncol, 2008,19(3):508-515.

[16] TEJPAR S, CELIK I, SCHLICHTING M, et al.Association of KRAS G13D tumor mutations with outcome in patients with metastatic colorectal cancer treated with first-line chemotherapy with or without cetuximab[J].J Clin Oncol, 2012,30(29):3570-3577.

[17] CRISTOFANILLI M, BUDD GT, ELLIS MJ, et al.Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer[J].N Engl J Med, 2004,351(8):781-791.

[18] CRISTOFANILLI M, HAYES DF, BUDD GT, et al.Circulating tumor cells: a novel prognostic factor for newly diagnosed metastatic breast cancer[J].J Clin Oncol, 2005,23(7):1420-1430.

[19] COHEN SJ, PUNT CJ, IANNOTTI N, et al.Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer[J].Ann Oncol, 2009,20(7):1223-1229.

MolecularDiagnosticApplicationsinthePostoperativeTreatmentofColorectalCancer

LIU Zhiqiang1, LI Shoumiao1, ZHANG Wei1, ZHANG Zhizhong1, WANG Yanjun2, LI Baozhong1
(1.TheFirstDepartmentofSurgery,theTumorHospitalofAnyang,Anyang455000,China; 2.TheFourDepartmentofSurgery,theTumorHospitalofAnyang,Anyang455000,China)

ObjectiveTo investigate the molecular diagnostic applications and its significance in the postoperative treatment of colorectal cancer.MethodsThe clinical data of 34 cases of colorectal cancer, expression levels of the excision repair cross-complementing, group 1 (ERCC1) mRNA and thymidylate synthetase (TYMS) mRNA, mutation rate of dihydropyrimidine dehydrogenase gene (DPYD), uridine diphosphoglucu-ronosyl transferase 1A1 (UGT1A1) were analyzed retrospectively.ResultsHigh expressions of ERCC1 and TYMS mRNA were 67.6% and 52.9%, ERCC1 mRNA expression level was negatively correlated with the number of metastatic lymph nodes.The DPYD, UGT1A1 mutation rates were 26.0%, 30.4%, the UGT1A1 mutation rate was negatively correlated with tumor differentiation of tumor.ConclusionMolecular diagnostics has the guiding significance in the postoperative treatment of colorectal cancer.

colorectal cancer; molecular diagnostics; drug susceptibility; toxicities; metastasis prediction

刘志强(1980-)，男，硕士，主治医师，主要从事消化系统肿瘤治疗工作。E-mail: lewzq@126.com

李保中(1967-)，男，主任医师，主要从事胃肠肿瘤个体化治疗工作。E-mail：libaozhong99@126.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.05.015

R735.3；R730.4

A

1673-5412(2017)05-0417-05

2016-01-15)