SOX4和E-cadherin在口腔鳞状细胞癌中的表达及临床意义

赵鹏飞， 王彬， 张兴伟， 王晓彤， 李勇， 焦晓辉

150001哈尔滨，哈尔滨医科大学附属口腔医学院 口腔颌面外科二病房

•临床经验与技术交流•

SOX4和E-cadherin在口腔鳞状细胞癌中的表达及临床意义

赵鹏飞， 王彬， 张兴伟， 王晓彤， 李勇， 焦晓辉△

150001哈尔滨，哈尔滨医科大学附属口腔医学院 口腔颌面外科二病房

目的研究转录因子SOX4(SRY-related HMG-box 4)和EMT相关蛋白上皮-钙黏蛋白(E-cadherin)在口腔鳞状细胞癌(OSCC)和正常人口腔黏膜(NOM)中的表达及相关性，为临床的诊断和治疗提供依据。方法利用免疫组化S-P法，检测50例口腔鳞状细胞癌、20例正常组织中SOX4和E-cadherin蛋白的表达，并与组织学分级、淋巴结转移和临床分期等生物学行为参数进行相关性分析。结果在OSCC组织中，SOX4和E-cadherin的阳性率分别为56.0%(28/50)和42.0%(21/50)；结合OSCC组织的临床病理特征发现，SOX4和E-cadherin与口腔鳞癌的病理分级、临床分期和是否有淋巴结转移密切相关，差异具有统计学意义(P<0.05)；SOX4的表达与E-cadherin的表达呈负相关，差异具有统计学意义(r=-0.552，P<0.05)。结论SOX4和E-cadherin的异常表达可能与口腔鳞癌的发生、发展、侵袭和转移密切相关，二者的联合检测可为口腔鳞癌的早期诊断、治疗和预后提供参考。

SOX4； E-cadherin； 口腔鳞状细胞癌； 免疫组织化学

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是口腔颌面部最常见的来源于上皮组织的恶性肿瘤，约占口腔颌面部恶性肿瘤的80%以上，约占全身恶性肿瘤的3%左右[1]。OSCC不仅危及生命，还影响患者的美观和外貌，以及咀嚼、吞咽和发音等生活质量。尽管目前有包括手术治疗、放化疗以及生物治疗等在内的综合序列治疗法，但长期疗效并不理想[2]，OSCC患者的五年生存率仍只有50%左右[3]。

SOX4是有关转录调节的SOX家族的C亚族成员[4]，有研究表明，SOX4在多种器官恶性肿瘤中被检测到表达升高，此外，SOX4激活TGF-β通路，诱导上皮 - 间质转化(EMT)，是癌症侵袭和转移的关键步骤[5-8]。上皮-钙粘蛋白(E-cadherin)是EMT过程中的重要标志[9]，参与细胞与细胞间的黏附作用，对维持细胞的极性和完整性起到了至关重要的作用，并在多种恶性肿瘤中被检测到表达降低[10]。

本研究采用免疫组织化学S-P法，检测SOX4和E-cadherin在口腔鳞癌组织中的表达，以探讨二者与临床病理参数间的关系及二者相互间的关系，以期为口腔鳞癌的早期诊断、治疗和预防提供新思路。

1 材料和方法

1.1 标本来源

随机选择2009年1月至2011年6月于哈尔滨医科大学附属口腔医学院就诊，经病理科确诊为口腔鳞状细胞癌患者的石蜡标本50例。其中男性32例，女性18例，年龄34～86岁；Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期20例；淋巴结转移20例，无淋巴结转移30例；高分化37例，中、低分化13例。所选病例患者均进行手术治疗，术前均未接受化疗、放疗或其他相关抗癌辅助治疗，病理分级以术后最终病理诊断为准。另选取20例正常口腔黏膜组织作为免疫组织化学染色对照。

1.2 主要试剂

兔抗人多克隆SOX4抗体(bs-11208R，北京博奥森生物技术有限公司)，兔抗人多克隆E-cadherin抗体(PB0583,武汉博士德生物技术有限公司)。免疫组化s-p试剂盒。

1.3 免疫组化方法

石蜡标本行4μm连续切片，常规HE染色观察并确认病理学改变；免疫组织化学行两步法检测SOX4和E-cadherin抗体表达情况，组织蜡片脱蜡水化后，柠檬酸抗原修复液修复抗原，3%去离子水封闭内源性过氧化物酶，分别滴入均按1：100稀释的SOX4和E-cadherin一抗工作液，4℃恒温孵育过夜；加入生物素化二抗，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片，晾干。PBS代替一抗做阴性对照。实验过程严格按照试剂说明书进行。

1.4 结果判定标准

所有操作由两位专职病理科医师以双盲法分别进行评估，然后相互交换切片，意见不一致时，由两位医师与上级医师共同讨论后做出最终判定。SOX4主要在细胞核上表达，E-cadherin主要在细胞浆和细胞膜上表达，故以细胞核、细胞浆或细胞膜被染情况作为判定标准。若出现黄色或棕黄色可视为阳性。参照文献报道[11-12]的方法，综合染色强度和阳性细胞占总细胞数的百分比进行半定量积分分析，1)若染色为棕褐色计3分，棕黄色计2分，浅黄色计1分，无着色计0分；2)将每张切片低倍显微镜下(×200)随机选取5个不重叠肿瘤组织的区域，高倍镜下(×400)计数每一百个细胞中癌细胞百分数，将5个视野的百分数相加取平均值作为判定结果来计算各分值组织中阳性肿瘤细胞所占面积百分比，即阳性细胞≤10%计1分，11%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分，阴性则计0分。将1、2项评分乘积作为总积分，0～1分为(-)，2～3分为(±)，4～5分为(+)，6～7分为(++)，≥8分为(+++)。

1.5 统计学分析

用Excel收集数据，采用SPSS16.0统计学软件将数据进行统计学分析，相关计数资料组间比较采用χ2检验，各组间相关性应用Spearman等级分析，检验水准为P<0.05差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 SOX4和E-cadherin在口腔鳞状细胞癌和正常口腔黏膜组织中的表达

SOX4在主要表达于细胞核中(图1、图2)，在口腔鳞状细胞癌组织中(图1箭头示阳性细胞)，SOX4表达的阳性率为56.0%(28/50)，在正常口腔黏膜中，SOX4表达的阳性率为30.0%(6/20)，二者间表达具有显著差异(P<0.05)，见表1。E-cadherin主要表达于细胞浆和细胞膜上(图3、图4)，在口腔鳞状细胞癌组织中(图3箭头示阳性细胞)，E-cadherin表达的阳性率为42.0%(21/50)，在正常口腔黏膜中表达的阳性率为75%(15/20)，二者具有显著差异(P<0.05)。

表1 SOX4和E-cadherin在正常口腔黏膜和口腔鳞癌组织中的表达

图1 SOX4在口腔鳞癌组织中的表达，箭头示阳性细胞(×400)图2 SOX4在正常口腔黏膜组织中的表达(×400)

图3 E-cadherin在口腔鳞癌组织中的表达，箭头示阳性细胞(×400)图4 E-cadherin在正常口腔黏膜组织中的表达(×400)

2.2 口腔鳞癌组织中SOX4和E-cadherin的表达与临床生物学指标的关系

在口腔鳞状细胞癌组织中，SOX4蛋白的表达与癌组织分化程度、临床分期和有无淋巴结转移显著相关，χ2分别为9.399、4.884、5.966(P<0.05)；E-cadherin蛋白的表达与癌组织分化程度、临床分期和有无淋巴结转移显著相关χ2分别为5.109、6.623、10.728(P<0.05)。而SOX4和E-cadherin的表达与患者的性别、年龄[13]和肿瘤大小均无关(P>0.05)(见表2)。

表2 SOX4和E-cadherin的表达与口腔鳞癌临床生物学的关系

2.3 口腔鳞癌组织中SOX4和E-cadherin表达的相关性分析

SOX4蛋白的表达和E-cadherin蛋白的表达经spearman等级分析结果表明，二者呈现明显负相关，差异具有统计学意义(r=-0.552，P<0.05，表3)。

表3 口腔鳞癌中SOX4和E-cadherin表达的相关性分析

3 讨 论

SOX4主要由N端的HMG结构域和C端的转录激活结构域(TAD)组成[5]，是一种单外显子基因，可以编码由474个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白质主要表达于细胞核；SOX4属于性别决定区域Y染色体(SRY)，有研究表明，其在胚胎发育过程中对睾丸的形成具有决定性作用，因此它对性别的形成至关重要[14]；先前的实验研究[15]显示，SOX4在小鼠的各个器官中都有特异性表达，尤其是对心脏的发育，敲除SOX4基因的小鼠胚胎会因心脏发育缺陷而死亡；在人胚胎组织中，SOX4广泛表达，其中在神经和间充质祖细胞中表达程度最高，在胚胎早期对维持神经和间充质祖细胞的正常发育发挥了重要作用。最近的研究报道，在各种器官肿瘤中检测到了SOX4的高水平表达，包括结肠癌[16]、前列腺癌[17]、膀胱癌[18]、肺癌[19]以及乳腺癌[20]等，此外，SOX4可诱导上皮-间质转化(EMT)，SOX4在EMT中发挥中心调控[21]作用，通过直接调节EMT中的一系列相关基因的表达来控制肿瘤的进展、细胞周期调控、细胞生存和细胞迁移，对肿瘤的发展至关重要。

EMT，是上皮细胞受到外界的物理、化学及生物等不良信号刺激后，细胞形态由上皮细胞向间质细胞转变的过程，细胞失去极性以及细胞-细胞黏附，同时增强了细胞的运动和迁移能力。细胞间的黏附作用是维持组织细胞正常形态和功能的基础，黏附作用的降低或消失将导致细胞分离游走甚至浸润和转移，即形成恶性肿瘤[22]。E-cadherin是一种钙依赖性的跨膜蛋白，其减少或丢失是EMT最重要的标志性变化[10]，其表达下调与多种上皮性肿瘤有关，如肺癌[23]、胃癌[24]等。

在肿瘤的进展过程中，有几个转录因子，如Snail、Slug/Snail2、ZEB1和ZEB2等可直接结合于E-cadherin启动子上抑制转录导致其被下调[25-26]，TGF-β是E-cadherin最重要的诱导剂[22]。SOX4可激活TGF-β通路，使其结合到它的受体TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ和TGF-βRⅢ导致smad2和smad3磷酸化和激活，smad2和smad3反过来和smad4形成三聚体，并且这个复合体转移到核内，在核内与其他DNA结合因子如Snail、ZEB和Twist一起调节TGF-β目的基因的表达，导致了E-cadherin的下调[27-28]。

为探讨OSCC中，SOX4和E-cadherin的表达异常以及二者之间表达的相互关系，本研究通过采用免疫组织化学的实验方法检测50例OSCC组织中SOX4和E-cadherin的表达。实验结果显示，与正常组织相比，OSCC组织中SOX4的阳性表达率显著升高，这表明SOX4可能参与了OSCC的发生、发展过程，并且是影响OSCC预后的重要因素。进一步分析发现，SOX4在各分化等级间的表达有差异，且差异具有统计学意义(P<0.05)，这与Watanabe等[29]的研究结果是一致的，且不论原发病灶分化程度如何，在转移的淋巴结组织中，SOX4的阳性表达均较高。而在临床分期中，SOX4在Ⅲ～Ⅳ期中的表达程度较Ⅰ～Ⅱ期高，且差异具有统计学意义(P<0.05)。在临床上病理分化程度越低、临床分期越高以及有淋巴结转移均提示患者预后越差，结合本实验结果，说明结果SOX4可作为判断OSCC预后的相关指标。

本研究结果显示，SOX4与E-cadherin在OSCC中的表达呈负相关(r=-0.552，P<0.05)，说明SOX4可能通过某种机制调节E-cadherin，进而调节EMT来调控恶性肿瘤的发展及侵袭能力。由实验结果得知，虽然随着肿瘤分化程度的降低，E-cadherin的表达显著降低，且差异具有统计学意义(P<0.05)，但仍有部分阳性表达，由此可推测，SOX4可以在不同分化程度的肿瘤中调节E-cadherin的表达缺失程度，但却不能完全阻遏E-cadherin的表达。在临床分期中，E-cadherin在Ⅲ～Ⅳ期中的表达程度较Ⅰ～Ⅱ期降低，在有淋巴结转移组中的表达较无淋巴结转移组的降低，且两组别差异均具有统计学意义(P<0.05)，由此可知，EMT不仅参与OSCC的发生、发展和转移，还与肿瘤的病理分级和临床分期具有一定的关系。

综上所述，SOX4和E-cadherin在口腔鳞状细胞癌的发生、发展、侵袭和转移中扮演着重要的角色，联合检测SOX4/E-cadherin的表达，可为恶性肿瘤的诊断、治疗和预后提供一定的参考，但二者在肿瘤中的作用机制和调控机制，还有待进一步深化研究。

作者声明：本文第一作者对于研究和撰写的论文出现的不端行为承担相应责任；

利益冲突：本文全部作者均认同文章无相关利益冲突；

学术不端：本文在初审、返修及出版前均通过中国知网(CNKI)科技期刊学术不端文献检测系统学术不端检测；

同行评议：经同行专家双盲外审，达到刊发要求。

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ExpressionandClinicalSignificanceofSOX4andE-cadherininOralSquamousCellCarcinoma

Zhao Pengfei, Wang Bin, Zhang Xingwei, Wang Xiaotong, Li Yong, Jiao Xiaohui△

(DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,CollegeofOralMedicine,HarbinMedicalUniversity,Harbin150000,Heilongjiang,China)

Objective: To evaluate the transcription factor SOX4 (SRY-related HMG-box 4) and EMT related protein (E-cadherin) in oral squamous cell carcinoma (OSCC) and normal oral mucosa (NOM) expression and correlation, provide the evidence for clinical diagnosis and treatment.MethodsUsing immunohistochemical S-P to detect the expression of SOX4 and E-cadherin protein in 50 cases of oral squamous cell carcinoma and in 20 cases of normal tissues. Correlation analysis with biological behavior parameters such as histological grade, lymph node metastasis and clinical stage was performed.ResultsIn OSCC tissues, the positive rates of SOX4 and E-cadherin were 56% (28/50) and 42% (21/50).Combined with the clinical pathological characteristics of OSCC, it was found that SOX4 and E-cadherin were closely related to the pathological grade, clinical stage and lymph node metastasis of oral squamous cell carcinoma, and the difference was statistically significant (P<0.05).At the same time, the expression of SOX4 was negatively correlated with the expression of E-cadherin in OSCC tissues, and the difference was statistically significant(r=-0.552,P<0.05).ConclusionThe abnormal expression of SOX4 and E-cadherin may be closely related to the occurrence, development, invasion and metastasis of oral squamous cell carcinoma. The combined detection of the two may provide a reference for early diagnosis, treatment and prognosis of oral squamous cell carcinoma.

SOX4；E-cadherin；OSCC；Immunohistochemistry

2016- 12- 22

2017- 05- 18

△焦晓辉,E-mail：jiaoxiaohuidoctor@163.com

R739.41

A

10.3969/j.issn.1674- 0904.2017.05.006

Zhao PF, Wang B, Zhang XW, et al. Expression and clinical significance of SOX4 and E-cadherin in oral squamous cell carcinoma[J]. J Cancer Control Treat, 2017,30(5):353-358.[赵鹏飞，王彬，张兴伟， 等. SOX4和E-cadherin在口腔鳞状细胞癌中的表达及临床意义[J].肿瘤预防与治疗，2017,30(5):353-358.]