鲢鱼鱼精蛋白超声波辅助提取工艺优化及其抗菌活性研究

刘光宪 - 祝水兰 - 何家林 - 周巾英 - 冯健雄 n-

(1. 江西省农业科学院，江西 南昌 330200；2. 江西师范大学，江西 南昌 330022) (1. Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang, Jiangxi 330200, China; 2. Jiangxi Normal University, Nanchang, Jiangxi 330022, China)

鲢鱼鱼精蛋白超声波辅助提取工艺优化及其抗菌活性研究

刘光宪1,2LIUGuang-xian1,2祝水兰1ZHUShui-lan1何家林1HEJia-lin1周巾英1ZHOUJin-ying1冯健雄1FENGJian-xiong1

(1. 江西省农业科学院，江西 南昌 330200；2. 江西师范大学，江西 南昌 330022) (1.JiangxiAcademyofAgriculturalSciences,Nanchang,Jiangxi330200,China; 2.JiangxiNormalUniversity,Nanchang,Jiangxi330022,China)

为了实现鲢鱼加工副产物的高效综合利用，以鲢鱼精巢为原料，研究柠檬酸浓度、提取温度、超声功率、提取时间、固液比、提取次数对鱼精蛋白得率的影响。在单因素试验基础上，通过正交试验获得最佳提取工艺为：柠檬酸浓度0.45 mol/L，温度55 ℃，超声时间20 min，超声功率400 W，固液比1∶30 (g/mL)，提取3次。在最佳工艺条件下，鱼精蛋白得率为3.25%；鱼精粗蛋白经Sepharose Fast Flow离子交换层析分离得到4个组分，对4个组分进行抗菌性分析可知，除鱼精蛋白的前体蛋白外，其他组分对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有较好的抑制活性，其中组分II、III的抑菌活性较好。

鲢鱼；超声波辅助提取；鱼精蛋白；离子交换纯化；抑菌

鱼精蛋白是一种鱼类成熟精巢组织中的多聚阳离子肽，一般与核酸结合在一起，以核精蛋白的形式存在，分子量约为4.0～4.5 kDa[1-2]。研究[3-5]表明，鱼精蛋白具广谱抑菌性、抗凝血性、抑制II型糖尿病以及促进消化道脂肪的消化等功能。鱼精蛋白的活性和鱼类精巢组织成熟度有关，从前体蛋白到成熟的鱼精蛋白，其抑菌性相应增加[6-7]。由于鱼精蛋白具有较好的生物活性，其提取及加工利用备受关注。刘燕妮等[8]从蛙鱼和鲤鱼中提取鱼精蛋白，研究显示提取的鱼精蛋白具有良好的抑菌活性；胡晓璐等[9]采用硫酸法从鱿鱼精巢中提取鱼精蛋白，研究显示鱼精蛋白得率为3.42%。目前，鱼精蛋白相关产品已被广泛地作为天然防腐剂和药物中间体应用于食品和药品生产中，市场需求量大。

鲢鱼是中国四大家鱼之一，其肉质鲜嫩，蛋白质丰富，但由于刺多，肉质土腥味重，导致其不受市场欢迎，鲜销量和价格均处于低水平，亟待进行精深加工以提高其附加值，近年来，鱼鳞、鱼皮、鱼精巢等加工副产物的综合高效利用已成为鲢鱼加工升值的热点研究课题。

超声波具有频率高、穿透能力强等特点，能产生空化效应和局部热点效果，多用于物料中有效成分的提取，其中在蛋白质[10]、油脂[11]、多酚[12]、多糖[13]、色素[14]的提取中均有应用。鱼精蛋白的提取方法主要是硫酸法[9]，而采用柠檬酸提取的研究较少。为了提高鲢鱼加工副产物(精巢)综合利用效益，本研究采用超声波辅助柠檬酸法提取鱼精蛋白，并对产物进行了分离纯化及抗菌性研究，旨在为鲢鱼精巢的加工利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

新鲜鲢鱼精巢：购买自南昌市青山湖社区菜市场；

考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白、CM Sepharose FF：生化级，北京索莱宝科技有限公司；

胰蛋白胨、牛肉膏、琼脂等：生化级，北京奥博星生物技术公司；

柠檬酸、氯化钠、无水乙醇等：分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌：南昌大学生命科学学院微生物研究室；

牛津杯(内径6 mm，外径8 mm，高10 mm)：上海精密仪器有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

紫外可见分光光度计：T6 新世纪型，北京普析通用仪器有限责任公司；

电热鼓风干燥箱：DHG-9140A型，上海一恒仪器厂；

超声波破碎仪：JY92-Ⅱ型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

循环水浴锅：HH-50型，金坛市天竟实验仪器厂；

自动液相色谱分离层析仪：MC99-3型，上海沪西分析仪器厂有限公司；

分析天平：TP-214型，北京赛多利斯仪器系统有限公司；

高速台式离心机：TGL-10C型，上海安亭科学仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 鱼精蛋白提取 以新鲜鲢鱼精巢为原料，参照文献[15]的提取方法修改如下：以0.15 mol/L NaCl 溶液提取、干燥得到的脱氧核糖核蛋白(DNP)为原料，研究不同柠檬酸浓度、提取温度、提取时间、超声波功率、固液比、提取次数对鱼精蛋白得率的影响。其中超声波提取采用6 mm探头，脉冲工作3 s，间隙8 s，其间为减小超声过程中产生的热量对提取温度的影响，采用对应提取温度的循环水浴连接水浴控温杯进行相对控温。各组提取液离心取上清液，用3倍体积的无水乙醇沉淀，沉淀用丙酮洗涤2次，真空干燥得到鱼精蛋白粗品。在单因素试验基础上，选取对得率影响较大的4个因素，开展3水平正交试验确定最佳提取工艺。

1.2.2 鱼精蛋白纯化 根据文献[16]的研究方法修改如下：将粗鱼精蛋白使用Sepharose Fast Flow离子交换层析柱分离纯化，以CM Sepharose FF作为柱填料，将样品溶液以柱体积的10%上样，并采用0～1 mol/L NaCl溶液作为洗脱溶剂，对蛋白进行梯度洗脱，洗脱流速为0.3 mL/min，洗脱液使用10 mL的试管接100管进行后续分析。

1.2.3 基本成分及得率测定

(1) 水分含量测定：按GB 5009.3—2016执行。

(2) 蛋白质含量测定：采用考马斯亮蓝法[17]。

(3) 核酸含量测定：采用定磷法。

(4) 脂肪含量测定：按GB 5009.6—2016执行。

(5) 灰分含量测定：按GB 5009.4—2016执行。

(6) 鱼精蛋白得率按式(1)计算：

(1)

式中：

C——鱼精蛋白得率，%；

m1——蛋白含量，g；

m2——鲢鱼精巢总质量，g。

1.2.4 抗菌活性的测定 根据文献[18]的方法修改如下：胰蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，NaCl 10 g，琼脂粉15 g，并将pH调至中性，用去离子水定容至1 L，将配置好的培养基用牛皮纸封口，高温灭菌，在超净台内倒入直径为 90 mm的培养皿中，每板10 mL，待培养基凝固之后，用浓度为10-6CFU的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌各5 μL进行涂板，并使用刮板器将菌液涂抹均匀后，将培养皿划线分为3个扇形区域，在每个区域中心放置牛津杯，并在每个牛津杯孔中加入20 μL经过纯化后的鱼精蛋白溶液(1 mg/mL)，以添加生理盐水作为空白。在室温下，待样品完全扩散后，置于37 ℃恒温箱中培养 72 h，观察并测量抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 成分分析

鲢鱼精巢的基本成分见表1，其蛋白质含量为(11.89±0.42)%，占精巢干重的52.22%，蛋白质含量介于蛙鱼、鲤鱼之间[8]，鲢鱼精巢脂肪和灰分含量少，由此可见其是一种优质的低脂高蛋白产品。

表1 鲢鱼精巢基本成分Table 1 Basic composition analysis of silver carp spermary %

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1 柠檬酸浓度对鱼精蛋白得率的影响 由图1可知，柠檬酸浓度在0.05～0.65 mol/L时，鱼精蛋白的得率随着柠檬酸浓度的增大先显著升高后降低(P<0.05)，在0.45 mol/L时得率达到最高(3.22%)。

2.2.2 提取温度对鱼精蛋白得率的影响 由图2可知，温度对鱼精蛋白得率的影响较大，鱼精蛋白的得率随提取温度的升高显著升高(P<0.05)，当温度达到50 ℃时，鱼精蛋白的得率为3.18%，当温度继续升高至55，60 ℃时，得率无显著性变化(P>0.05)，且提取的鱼精蛋白溶液颜色发黄，因此，选择50 ℃较为合适。

不同字母表示在0.05水平差异显著图1 柠檬酸浓度对鱼精蛋白得率的影响Figure 1 Effects of concentration of citric acid on the yield of protamine

不同字母表示在0.05水平差异显著图2 提取温度对鱼精蛋白得率的影响Figure 2 Effects of concentration of extraction temperature on the yield of protamine

2.2.3 超声时间对鱼精蛋白得率的影响 由图3可知，超声时间在10～60 min时，鱼精蛋白的得率先升高后降低，在30 min时得率达到最高，随后显著降低(P<0.05)。

2.2.4 超声功率对鱼精蛋白得率的影响 由图4可知，随着超声波功率增大，鱼精蛋白的得率先显著升高后降低(P<0.05)，在400 W时得率达3.22%。当超声功率>400 W，超声波产生的局部热点可能导致蛋白质的碳化或水解，使其得率显著降低(P<0.05)。因此，超声波功率选择400 W较为合适。

不同字母表示在0.05水平差异显著图3 超声时间对鱼精蛋白得率的影响Figure 3 Effects of ultrasonic time on the yield of protamine

不同字母表示在0.05水平差异显著图4 超声功率对鱼精蛋白得率的影响Figure 4 Effects of ultrasonic power on the yield of protamine

2.2.5 固液比对鱼精蛋白得率的影响 由图5可知，固液比在1∶10～1∶30 (g/mL)时，鱼精蛋白的得率显著增加(P<0.05)，固液比为1∶30 (g/mL)时，得率达到最大。固液比为1∶30 (g/mL)之后，得率无显著性变化(P>0.05)，可能是底物浓度过大导致底物黏度增大而影响提取效率。

2.2.6 提取次数对鱼精蛋白得率的影响 由图6可知，随着提取次数增加，鱼精蛋白的提取得率增加，提取3次时，得率最大，提取次数超过3次，鱼精蛋白的得率无显著变化(P>0.05)。

2.3 正交试验

综合单因素试验结果发现，柠檬酸浓度、提取温度、超声时间和超声功率4个因素对鱼精蛋白提取得率的影响较大，因此选择这4个因素，进行3水平正交试验。试验因素水平取值见表2，正交试验中每组开展3次平行试验，得率取平均值，结果见表3。

不同字母表示在0.05水平差异显著图5 固液比对鱼精蛋白得率的影响Figure 5 Effects of solid-liquid rate on the yield of protamine

不同字母表示在0.05水平差异显著图6 提取次数对鱼精蛋白得率的影响Figure 6 Effects of extraction time on the yield of protamine

表2 L9(34)正交因素水平表Table 2 Factors and levels of L9(34) orthogonal design

表3 鱼精蛋白提取工艺的L9(34)正交试验结果Table 3 L9(34) orthogonal design and result of the extraction of protamine

由表3可知，影响鱼精蛋白得率的因素主次为：A>D>B>C，最优提取工艺组合为A2B3C1D2，恰为表3得分最高组。故鱼精蛋白的最优提取工艺为柠檬酸浓度0.45 mol/L，提取温度55 ℃，超声时间20 min，超声功率400 W，固液比1∶30 (g/mL)，提取3次。

2.4 鱼精蛋白的纯化及其抗菌活性研究

2.4.1 分离纯化 鱼精蛋白是一种碱性蛋白，因此选择CM Sepharose FF为离子交换层析柱填料，提取得到的鱼精蛋白经Sepharose Fast Flow离子交换层析柱分离纯化后，得到4个主要组分(见图7)。

由图7可知，10～20管是用未含盐的溶液洗脱，吸收峰较小，为没有被填料吸附的前体蛋白；32～100管是用含有NaCl 0.3～1.0 mol/L的缓冲液进行线性洗脱，有I、II、III 3个峰出现，分别收集、透析脱盐、减压浓缩后进行抗菌试验。

2.4.2 抑菌活性研究 对分离得到的4个组分进行抑菌研究，抑菌圈研究结果见图8和表4。结果表明，当蛋白质浓度为1 mg/mL时，在pH为7的中性环境下，除前体蛋白外，鱼精蛋白各组分对沙门氏菌(图8A和B)、金黄色葡萄球菌(图8C和D)和大肠杆菌(图8E和F)均具有抑制活性，其中组分II和组分III的抑菌活性较好。

图7 鱼精蛋白离子交换层析图谱Figure 7 Analysis atlas of protamine treated by ion-exchange chromatography

图8 鱼精蛋白各组分对沙门氏菌、金黄色球菌和 大肠杆菌的抑制

Figure 8 Inhibitory effect of protamine components onsalmonella,staphylococcusaureusandescherichiacoli

表4鱼精蛋白各组分对沙门氏菌、金黄色球菌和大肠杆菌的抑制效果

Table 4 Inhibitory effect of protamine components onSalmonella,StaphylococcusaureusandEscherichiacolicm

由表4可知，组分II的抑菌效果明显要强于组分I和组分III，组分III的抑制效果要好于组分I。

3 结论

超声波辅助柠檬酸法提取鱼精蛋白的最佳提取工艺为：柠檬酸浓度0.45 mol/L，提取温度55 ℃，超声时间20 min，超声功率400 W，固液比1∶30 (g/mL)，提取3次，在此工艺条件下提取鱼精蛋白得率可达到3.25%；对提取之后的粗鱼精蛋白进行分离纯化获得4个组分，除前体蛋白外，其他3个组分对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有抑制活性，其中组分II 和组分III的抑菌活性较好。为了揭示不同种类鱼的鱼精蛋白活性差异，今后可开展鲢鱼鱼精蛋白与其他鱼类鱼精蛋白的活性比较研究。

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Optimizationofextractionprocessassistedbyultrasonicandantibacterialactivityevaluationontheprotaminefromsilvercarp

To realize the high comprehensive utilization on the byproduct of silver carp, taking the testis sacs of silver carp as the raw material, the effects were studied, including the concentration of citric acid, the temperature, ultrasonic power, ultrasonic time, solid-liquid rate and extraction times on the efficacy extraction of silver carp spermary. On the base of single-factor experiments, and through the orthogonal test, the optimization experiment conditions were as followed: concentration of citric acid 0.45 mol/L, extraction temperature 55 ℃, the ultrasonic time 20 min , ultrasonic power 400 W, ratio of solid-liquid 1∶30, and the extraction times 3 times. The extraction ratio of chub protamine was 3.25% at the optimized conditions. Four groups chub protamine were purified and separated through sepharose fast flow ion-exchanged chromatography. By studying the antibacterial activities of the four group, excepting the precursor protein, the other groups had a good inhibition on thesalmonella,staphylococcusaureusandescherichiacoli, especially the group II and III.

silver carp; ultrasonic assisted extraction; protamine; ion-exchange chromatography; anti-bacteria

江西省农业科学院青年基金(编号：2015CQN002)；江西省科技计划(编号：20161BBF60134)

刘光宪，男，江西省农业科学院助理研究员，江西师范大学在读博士研究生。

冯健雄(1963—)，男，江西省农业科学院研究员，学士。

E-mail: fjx630320@163.com

2017—04—06

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.09.032