妊娠晚期3种自体血贮存方法对红细胞凝集状态的影响

丁杰锋 陈海江 桑列勇 吴云路 杨旦

妊娠晚期3种自体血贮存方法对红细胞凝集状态的影响

丁杰锋 陈海江 桑列勇 吴云路 杨旦

目的通过对红细胞凝集状态作镜下直观比较，探究妊娠晚期3种自体血贮存方案的优劣，为临床更好的开展贮存式自体输血提供依据。方法选择2011年1月至2014年6月有自体输血指征的106例孕妇，按照贮存方案不同，将自体血分成标准抗凝组（30例）、扩大抗凝组（25例）、自体成分组（51例），采用并行留样，于10×50倍镜下观察红细胞聚集状态，观察时间点设为：24h，第7、14、21天。每组每个时间点观察200个红细胞，并计数其中游离红细胞的数目。结果标准抗凝组：保存至第3天红细胞就出现线串样凝集，游离红细胞数目急剧下降；扩大抗凝组：保存至第7天红细胞发生线串样凝集，第14天时游离红细胞数量急剧地下降；自体成分组：24h至第21天，不同时间点几乎所有红细胞均呈游离状态。结论在妊娠晚期行自体贮血，标准比例抗凝方案已经不可取；扩大抗凝方案可以延缓血液凝集，但血液保存超过7d，不推荐临床使用；而对自体血进行成分分离后保存，可以长时间保持红细胞的游离状态，是一种值得推广的新方案。

妊娠晚期自体输血标准抗凝扩大抗凝自体成分血

近年来，贮存式自体输血（preoperative autologous blood donation，PABD）以其独特的优势在妇产科领域中被广泛应用[1-3]，尤其是在产科，因为平产或剖腹产手术时间可以预知，产前经过充分的检查诊断，产科医生对患者是否出血和出血量有一定的估计；同时，对一些稀有血型和不规则抗体阳性的孕妇，选择PABD更能为安全分娩提供保障。产科自体输血的血液采集时间一般为产前15～25d，此时已属于妊娠晚期阶段，这一阶段孕妇的血液处于高凝状态，原因如下：（1）随着孕周的增加，血液中纤维蛋白原（FIB）水平逐渐升高，同时凝血因子增加，使得血液日趋呈高凝状态[4]，加之产科自体血贮存时间较长，较高水平FIB与凝血因子容易发生凝血反应而形成小凝块。（2）高水平FIB改变了红细胞表面的负电荷，使负电荷降低，拉近了红细胞间的距离；同时FIB易在血液中形成网络，具有桥联力作用[5]，可使红细胞柔顺性受损、可塑变形能力大大降低，易于聚集。基于此，我们提出以下假设：（1）由于血液处于高凝状态，欲行自体输血的妊娠晚期孕妇，在血液贮存时采用标准比例抗凝剂抗凝，可能不会收到良好的抗凝效果，而血浆中FIB和红细胞的共同作用将进一步增加此阶段血液的易凝固性；（2）扩大抗凝比例可以提高妊娠晚期自体血贮存效果；（3）将妊娠晚期自体血进行成分分离后保存，可以提高妊娠晚期自体血贮存效果。为了验证以上假设，笔者设计了3种不同的妊娠晚期血液保存方案，并通过对红细胞凝集状态作镜下直观比较，探究3种方案的优劣，为临床更好的开展PABD提供依据。

（正文见第1771 页）

图1 标准抗凝组镜下观察结果（a:0h；b:24h；c:第3天；d:第7天；e:第14天；f:第21天；10×50）

图2 扩大抗凝组镜下观察结果（a:24h；b:第7天；c:第14天；d:第21天；10×50）

图3 自体成分组镜下观察结果（a:24h；b:第7天；c:第14天；d:第21天；10×50）

1 资料和方法

1.1 一般资料选择2011年1月至2014年6月有自体输血指征的妊娠晚期孕妇106例，年龄22～35（26.50±3.45）岁；体重47～78kg，中位数61kg。自体采血指征：排除心血管系统疾病、糖尿病、妊娠期高血压疾病、感染性疾病、内科合并症之后，要求无产兆、病情稳定无阴道出血，胎儿无生长受限和宫内缺氧的表现；同时需满足Hb＞105g/L，Plt＞100×109/L。符合以上条件者实施PABD，采血时机于手术前15～25d，所有自体输血患者采血前均签署自体输血知情同意书。

1.2 材料与器材自体采血血袋（长春泰尔茂，血袋批号：20120612、20130226，300、400ml血袋内分别含红细胞保养液42、56ml）；显微镜成像系统（奥林巴斯CX31）；载玻片、盖玻片（上海机械进出口集团公司）；血液离心机（美国贝克曼公司）。

1.3 贮存方案和分组根据不同的贮存方案进行分组，贮存方案一：标准抗凝组30例，用正常抗凝剂容量的血袋采集自体血，即用300ml血袋采集300ml自体血；采用CPDA全血保养液抗凝，采血后混匀并储存于（4±2）℃储血冰箱。贮存方案二：扩大抗凝组25例，采用增加抗凝剂容量的血袋采集自体血，即用300ml血袋采集200ml自体血；采血后混匀并储存于（4±2）℃储血冰箱。贮存方案三：自体成分组51例，用正常抗凝剂容量的血袋采集自体血，即用300ml血袋采集300ml自体血，并将自体血在6h内分离制备成悬浮红细胞和新鲜冰冻血浆，全程保证在冷链状态。

1.4 方法

1.4.1 成分血制备离心前进行血袋检查：检查多联袋有无破损、标签是否齐全、一致。将准备进行离心的全血配平前在电脑上进行离心机的使用登记，登记内容涉及血液品种、献血编号、离心机机号、离心日期、时间、转速、温度等重要信息。配平离心：将登记后的全血放于离心机专用套筒中，然后用血液配平仪进行配平，配平后，放入离心机中进行离心。离心参数：离心温度2～6℃，离心速度5 000g，离心时间10min。观察离心完毕的全血分层是否清晰及血袋外观是否正常等信息后在低温操作台上使用血浆挤压器将上层血浆分离至空转移袋（制备血浆用）。并将另一转移袋内红细胞添加液加入红细胞内，将保养液与红细胞充分摇匀，即成红细胞悬液。热合封口、检查热合点是否密闭，检查母袋与转移袋的献血编号是否一致，此过程注意观察红细胞内有无凝块、破损等异常情况。

1.4.2 形态学观察3组自体血均采用并行留样，于10×50倍下观察红细胞聚集状态，观察时间点设为：24h、第7、14、21天。对于标准抗凝组，增加0h及第3d两个时间点。凝集红细胞团判断标准：3个及3个红细胞凝集在一起判断为一个凝集红细胞团。每组每个时间点观察200个红细胞，并计数其中游离红细胞的数目，镜下拍照记录。

1.5 统计学处理应用SPSS 19.0统计软件，计量资料用表示，组间比较采用单因素方差检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标准抗凝组镜下情况观察血液标准抗凝后，0h观察显示红细胞几乎均呈游离状态，24h后红细胞出现2～3个细胞凝集，在镜下滴加0.9%氯化钠溶液，红细胞恢复正常形态；保存第3天的全血中红细胞在短时间内发生线串样凝集。在镜下滴加0.9%氯化钠溶液红细胞恢复正常形态；第7天时红细胞呈紧密线串样并轻微变形，在镜下滴加0.9%氯化钠溶液红细胞未恢复散开形态；保存至第14天时，线串样凝集逐渐紧密，同时可见纤维蛋白丝析出在红细胞团周围，并出现团状黏液结构。保存至第21天时，出现黏液结构并呈团状，红细胞连接成网状结构并部分溶血（见图1，插页）。

2.2 扩大抗凝组镜下情况观察采集后24h红细胞几乎未出现细胞凝集；保存第7天的全血中红细胞在短时间内发生线串样凝集，在镜下滴加0.9%氯化钠溶液红细胞恢复正常形态；第14天时红细胞呈紧密线串样并轻微变形，在镜下滴加0.9%氯化钠溶液红细胞未恢复散开形态；保存至第21天时，线串样凝集逐渐紧密，同时可见纤维蛋白丝析出在红细胞团周围，并出现团状黏液结构（见图2，插页）。

2.3 自体成分组镜下情况观察成分分离后24h红细胞未出现细胞凝集，红细胞形态正常；保存7d的自体悬浮的红细胞呈散在分布，出现微量棘状突起。在镜下滴加0.9%氯化钠溶液红细胞恢复正常形态；保存至第14天自体悬浮红细胞呈散在分布，棘状突起增多。保存至第21天自体悬浮红细胞无凝集出现，呈散在分布，异形红细胞增多（见图3，插页）。

2.4 3组游离红细胞数目比较标准抗凝组除24h外，在第7、14、21天时游离红细胞数目均明显减少；扩大抗凝组24h红细胞几乎均呈游离状态，于第7天约十分之一细胞出现凝集，但在第14天游离红细胞数目明显减少，至第21天时，只有个别红细胞呈游离状态；自体成分组自24h至第21天，在保存过程中红细胞几乎均呈游离状态。详见表1。

表1 3组游离红细胞数目比较（个）

3 讨论

自体输血在妇产科应用日益广泛[6-7]，但自体输血在应用过程中，产妇妊娠期特殊的生理状态，影响了自体血液的保存与回输，进而影响了自体输血在产科的应用[8-10]。国外有研究表明不建议在妊娠第三阶段进行PABD[11]。这主要由妊娠期生理因素变化：妊娠3周开始孕妇血液中凝血因子Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ逐渐增多，而抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）、组织纤溶酶原激活剂（t-PA）和肾合成的尿激酶（u-PA）降低，胎盘产生的纤溶酶原激活物抑制物增多[4]，血液渐趋高凝状态，妊娠末期最明显。由于孕妇血液的高凝状态，在标准抗凝的条件下，孕妇血液随着时间延长，血液呈现部分凝集。日本学者发现妊娠期采血的患者在自体血回输时，在输血器中发现血液凝块[12]。可见标准抗凝的自体全血保存，随着血液贮存时间的延长，血液容易出现凝集。这个结果与我们观察结果相同。

从镜下观察结果来看，采用标准抗凝的妊娠期全血，实际上在24h已开始出现轻微凝集，保存第3天的全血中红细胞在短时间内发生线串样凝集，至保存第7天时的红细胞呈紧密线串样并轻微变形，而保存第14天时，可见纤维蛋白丝析出在红细胞团周围，并出现团状黏液结构。保存至第21天时，出现黏液结构并呈团状，红细胞连接成网状结构并部分溶血。游离红细胞数目自第3天起开始急剧下降，这表明，由于妊娠晚期孕妇的血液处于高凝状态，标准抗凝的自体全血超过3d实际上已经失去了回输价值，因此对于妊娠晚期孕妇来讲，采用标准比例抗凝是行不通的。

采用扩大抗凝的妊娠期全血，保存24h红细胞呈散在分布，至第7天开始出现少量凝集，第14天时出串样凝集，保存至第21天时，线串样凝集逐渐紧密，游离红细胞数目自第7天起逐渐减少，至第14天已经明显减少，这表明扩大抗凝的妊娠期全血虽然能在一定程度上改善血液保存状态，延缓血液凝固的时间，但对于保存期已超过7d的血液，仍不建议回输，因为此时红细胞已有较为明显的不可逆的凝集，此时回输虽不是绝对不可以，但回输速度缓慢，输血部位疼痛等问题出现的概率将明显增加，影响临床疗效。

采用成分分离的自体血，自始至终红细胞都维持游离状态，计数200个红细胞中游离红细胞数量，不同时间点几乎所有细胞均呈游离状态，虽然随着保存时间的增加，棘形红细胞、异形红细胞逐渐增多，但是较之于前两组而言，血液保存质量仍旧得到了明显的改善；而从实际效果上来看，自体成分血的回输效果是最好的，不管是输注速度，凝块大小及数量，输血的不良反应等，均是3种自体血保存方法中最优的。

综上所述，由于妊娠晚期孕妇血液处于高凝状态，标准比例抗凝方案已经不可取；扩大抗凝方案可以一定程度上延缓红细胞聚集速度，但对于贮存期超过7d的血液，笔者仍不推荐使用；而对自体血进行成分分离保存，能够较好的解决妊娠晚期孕妇血液易凝这一难题，是一种值得推广的新方案。

[1] Watanabe N,Suzuki T,Ogawa K,et al.Five-year study assessing the feasibility and safety of autologous blood transfusion in pregnant Japanese women[J].J Obstet Gynaecol Res,2011,37(12):1773-1777.doi:10.1111/j.1447-0756.2011.01605.x.

[2] Chermnich S,Mogilevkina I,Knurov I.Cesarean section(CS)with autologous blood/plasma transfusion(ABT/APT)can prevent postpartum complications[J].International Journal of Gynecology&Obstetrics,2000,70:C84.doi:10.1016/S0020-7292(00)80586-X.

[3] Rajan P V,Wing D A.Postpartum hemorrhage:evidence-based medical interventions for prevention and treatment[J].Clin Obstet Gynecol,2010,53:165-181.

[4] Regis D,Corallo F,Franchini M,et al.Preoperative autologous blood donation in primary totalknee arthroplasty:criticalreview of current indications[J].Chir Organi Mov,2008,91(1):41-44.doi:10.1111/j.1423-0410.2006.00750.x.

[5] 翟艳苓,刘复强,刘壮,等.红细胞聚集增高与纤维蛋白原的关系及其对心绞痛患者发病的影响[J].微循环学杂志,2004,14(1):36-37.doi:10.3969/j.issn.1005-1740.2004.01.015.

[6] Henry D A,Carless P A,Moxey A J,et al.Pre-operative autologousdonation for minimisingperioperative allogeneicblood transfusion[J].Cochrane Database Syst Rev,2002,2:CD003602.doi:10.1002/14651858.CD003602.

[7] Garcia-Erce J A,Munoz M,Bisbe E,et al.Predeposit autologous donation in spinal surgery:a multicentre study[J].Eur Spine J,2004,13(Suppl1):S34-39.doi:10.1007/s00586-004-0726-0.

[8] Hovav T,Yedgar S,Manny N,et al.Alteration of red cellaggregability and shape during blood storage[J].Transfusion,1999,3(39):277-281.doi:10.1046/j.1537-2995.1999.39399219284.x.

[9] Liumbruno G M,Liumbruno C,Rafanelli D.Autologous blood in obstetrics:where are we going now?[J].Blood Transfus,2012,10(2):125-147.doi:10.2450/2011.0010-11.

[10] Weiskopf R B,Feiner J,Toy P.Red blood cell age and function[J].Transfusion,2008,48(9):2026.doi:10.1111/j.1573-2995.2008.01833.x.

[11] Goldman M,Savard R,Long A,et al.Declining value of preoperative autologous donation[J].Transfusion,2002,42(7):819-823.doi:10.1046/j.1537-2995.2002.00132.x

[12] Morikawa M,Kuramoto A,Nakayama M,et al.Intraoperative red cellsalvage during obstetric surgery in 50 Japanese women[J].Int J Gynaecol Obstet,2015,128(3):256-259.doi:10.1016/j.ijgo.2014.09.008.

Comparison of three different methods for autologous blood storage in late pregnant women

DING Jiefeng,CHEN Haijiang,SANG Lieyong,et al.

Clinical Laboratory,Shaoxing Women and Children's Hospital,Shaoxing 312000,China

Objective To compare three different methods for autologous blood storage in late pregnant women.Methods One hundred and six pregnant women with indications of autotransfusion from January 2011 to June 2014 were enrolled.The autologous blood samples were collected and stored using three different methods:standard anticoagulation,extended anticoagulation and autologous components.The aggregation degree of red cells was observed under microscope(10×50)after 24h,7,14 and 21d of storage.Two hundred red cells of each group were observed and the number of free red cells was counted.Results The red blood cells in standard anticoagulation group began rouleau-like agglutination at d3 and the number of free red cells decreased dramatically;the red blood cells in extended anticoagulation began rouleau-like agglutination at d7 and the number of free red cells decreased dramatically at d3;while in autologous components group,nearly all red cells were free from 24h to 21d after storage.Conclusion The separation of the blood component is the best method for storage of autologous blood in late pregnancy.

Late pregnancy Autotransfusion Standard anticoagulation Extended anticoagulation Autologous blood components

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.20.2016-2109

浙江省卫生适宜技术成果转化计划项目（2016ZHB030）；浙江省医药卫生科技计划项目（2012KYB216）

312000绍兴市妇幼保健院医学检验科（丁杰锋、吴云路），输血科（陈海江、杨旦）；绍兴市中心血站（桑列勇）

丁杰锋，E-mail:djfyd@163.com

2016-12-15）

（本文编辑：严玮雯）