改良枕大池二次注血法建立大鼠蛛网膜下腔出血模型

单宏宽　刘刚

【摘要】 目的：建立大鼠蛛网膜下腔出血模型，通过研究其出血后认知、行为学改变，基底动脉变化探讨枕大池穿刺二次注入自体动脉血溶血物法建立大鼠蛛网膜下腔出血模型的实际可行性。方法：将72只清洁级雄性SD大鼠（体重300～350 g）随机分成对照组（n=12只）、实验组（n=60只）。实验组又分别划分为出血后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d 5个时相组，每个时相组各12只大鼠。造模后，通过水迷宫试验观察各时相点大鼠蛛网膜下腔出血后的认知、行为学改变，评价大鼠的学习记忆功能障碍。结果：水迷宫结果显示实验组大鼠与正常对照组比较，逃避潜伏期明显延长，跨越平台次数减少，差异均有统计学意义（P<0.05）。大体标本观察，对照组脑蛛网膜下腔未见出血，实验组大鼠蛛网膜下腔出血明显，可见有大量血液或血凝块弥漫分布于蛛网膜下腔。结论：枕大池穿刺二次注入自体动脉血溶血物法建立模型操作简便易行，可重复性强，大鼠学习记忆功能障碍改变明显。大鼠基底动脉痉挛明显，模型复制成功。

【关键词】 蛛网膜下腔出血； 动物模型； 注血法； 水迷宫

The SAH Model by Improved Two Times Injections of Arterial Blood Solvate into Cisterna Magna Directly in Rats/SHAN Hong-kuan，LIU Gang.//Medical Innovation of China，2017，14（22）：016-020

【Abstract】 Objective：To study the practical feasibility of two times injections of arterial blood solvate into cisterna magna directly by establishing SAH model in rats by observating the cognitive and behavioral change after subarachnoid hemorrhage in rats.Method：72 clean-level male SD rats were randomly divided into control group（n=12） and experimental group（n=60）.Experimental group were randomly divided into 12 h，24 h，48 h，

3 d，5 d group，12 rats in each group.After modeling，the cognitive and behavioral changes of subarachnoid hemorrhage in rats at different time points by water maze test were observed，the learning and memory impairment in rats were evaluated.Result：Morris water maze showed that the escape latency was prolonged significantly and the number of cross-platform reduced in each group of SAH compared with those of experimental group，the differences were statistically significant（P<0.05）.In general observation，there was no hemorrhage in the subarachnoid space of the control group.The subarachnoid hemorrhage in the experimental group was obvious，and there was a large amount of blood or blood clot distributed around the subarachnoid space.Conclusion：It is easy to perform and repeat the SAH model in rats established by two times injections of arterial blood solvate into cisterna magna directly， whose clinical symptoms and the dysfunction of learning and memory are changed significantly.The artery cramps obviously，which meant the model is established successfully.

【Key words】 Subarachnoid hemorrhage； Animal mode； Blood injection； Morris water maze

First-authors address：Liaocheng Central Hospital of Shandong Province，Liaocheng 252000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.22.005

蛛網膜下腔出血（Subarachnoid hemorrhage，SAH）是临床常见的脑血管疾病，死亡率及致残率高，目前对于该病早期的高死亡率知之甚少，因此动物实验成为研究的重要方法。建立一种操作简单、发病机制相似的动物模型来研究SAH后的病理生理变化，对临床治疗具有重要的指导意义。本研究采用枕大池穿刺二次注入自体动脉血溶血物法建立大鼠蛛网膜下腔出血模型，通过研究其出血后认知、行为学改变，探讨模型的可靠性，以期提供简单、可靠的SAH动物模型制作方法。endprint

1 材料與方法

1.1 材料 72只清洁级雄性SD大鼠（体重300～350 g）随机分成假手术组即对照组（n=12只）、实验组（n=60只）。实验组又分别划分为出血后

12 h、24 h、48 h、3 d、5 d 5个时相组，每个时相组各12只大鼠。对各组大鼠采用枕大池穿刺二次注入自体动脉血溶血物法建立蛛网膜下腔出血模型。对照组、实验组大鼠分别于注血后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d进行水迷宫测试。

1.2 方法 （1）采用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔麻醉；暴露、分离左侧股动脉，抽取不抗凝的动脉血0.3 mL，将血液迅速置于-80 ℃冰箱冷冻15 min，然后在恒温水浴箱中37 ℃复溶后得到动脉血溶血物。枕部局部消毒，取侧卧位，保持头部向胸部屈曲，先在正中线枕骨隆凸下缘至第一颈椎上缘间切一小切口，用1 mL注射器自制细穿刺针穿刺，注意针尾略向尾部倾斜，垂直缓慢进针直至有突破感停止，表示针头已穿透硬膜进入枕大池，待清亮脑脊液缓慢流出。SAH组缓慢注射复溶的自体股动脉血0.3 mL，时间控制在5 min，拔出穿刺针，大鼠俯卧位，头低30°放置30 min，缝合股部切口。注血完毕时，可观察到大鼠的呼吸节律明显改变，甚至出现呼吸暂停，个别大鼠出现短暂性后肢抽搐。麻醉醒后正常饲养，24 h后同法抽取右侧股动脉血0.3 mL处理后注入枕大池，制成大鼠SAH动物模型。对照组同样取血，但不注射，24 h后重复上述操作。注血后大鼠腹腔注射青霉素钠10万U，连续3 d。（2）Motris水迷宫测试（认知、行为学观察）：实验于注血后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d时进行。测试前大鼠按试验分组先进行水迷宫适应性学习训练，水中加入适量墨汁，水平面高过安全平台10 mm，水温保持在22～26 ℃，将安全平台置于训练时水迷宫象限中的任一象限（N、S、E、W），由摄像机及计算机自动跟踪拍摄和统计大鼠分别由其他三个象限入水后寻找到安全平台的轨迹和潜伏期值。如大鼠60 s内未找到安全平台，则潜伏期值记为60 s。术后48 h水迷宫试验结束后每组随机抽取5只采用过度麻醉断头处死，迅速开颅取脑，行大体标本观察。

1.3 观察指标 测试程序主要包括定位航行试验和平台搜索试验，共5 d，每天上、下午各进行4次。将大鼠面向池壁分别从四个象限的入水点放入水中，记录其在60 s内寻找到平台的时间，即为逃避潜伏期。如果大鼠60s内不能找到平台，则由实验者用工具牵引其到平台上停留，再放回到笼中，此项反应为大鼠的学习能力。模型建立后的神经行为学评估：分别于术前、术后24 h、48 h对大鼠进行评分。参考Kaoutzanis等[1]神经行为学评分法进行评分，得分范围为3～11分，3分最差，11分完全正常，并进行行为学及颅脑解剖观察。

1.4 统计学处理 使用SPSS 17.0统计软件进行分析，对每个时间点上6个分组的重复测量数据进行方差分析和多元方差分析，并进行不同时间点和不同组间的两两比较，计量资料采用（x±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠神经行为学评分情况 根据表1评分超过9分的大鼠排除实验，评分符合者进入下一步骤。术后死亡作为缺失值，亦予以排除。排除者均在后续实验中随机补足，保证分组且每组数量恒定。整个实验过程造模失败、死亡大鼠17只。

2.2 大鼠逃避潜伏期实验结果 水迷宫逃避潜伏期结果显示蛛网膜下腔注血后12、24、48 h组大鼠定向航行速度较慢，游泳时间明显延长，分别为（26.44±1.90）、（57.93±2.28）、（41.94±3.99）s与对照组（5.36±0.65）s比较差异有统计学意义（P<0.05）；3、5 d组有所延长分别为（14.80±3.37）、（7.57±0.45）s，5 d组与对照组相比差异无统计学意义（P=0.056）。证明大鼠蛛网膜下腔注血后12～48 h学习记忆功能障碍明显，3 d之后逐渐恢复。

2.3 大鼠平台搜索试验结果 平台搜索结果表明蛛网膜下腔注血后12、24、48 h组大鼠经过平台次数明显减少分别为（3.89±0.41）、（1.14±0.66）、（4.96±0.85）次，与对照组（10.68±0.66）次比较差异均有统计学意义（P<0.05）；3、5 d组穿越平台次数有所增加分别为（8.25±0.86）、（9.96±0.30）次，5 d组与对照组相比差异无统计学意义（P=0.25），证明大鼠蛛网膜下腔注血后12～48 h学习记忆功能障碍明显，3 d之后有所恢复。对照组及SAH不同时间组平台搜索差异见图1，典型标本见图2～3。

2.4 动物行为及大体标本观察结果 实验组大鼠术后意识恢复时间为12～16 h，呈头低位蜷缩状，活动明显减少，且毛发蓬松、摄食减少，未见偏瘫或截瘫，部分大鼠可见球结膜下出血。动物体重在第一次手术后至第二次手术前平均下降约20 g；神经功能障碍随着时间延续逐渐减轻，持续到第3天明显缓解，第5天除饮食略差外神经症状基本消失。对照组大鼠术后恢复清醒时间为4～6 h，且饮水、摄食及活动较术前相比均无明显差异。对照组未见蛛网膜下腔有出血及血凝块（图2），所有动物均未见脑实质损伤。实验组大鼠蛛网膜下腔出血明显，可见大量血液或血凝块弥漫分布于蛛网膜下腔，血凝块多沉积于视交叉、基底动脉周围及基底池、侧裂池、纵裂，颞叶底面内侧半球表面也可见血液沉积（图3）。血液及血凝块的范围、厚度随时间延长而减少，一周左右消失。

3 讨论

由于蛛网膜下腔出血病情危重、死亡率高，因此建立一种操作简单、发病机制相似的动物模型进行研究成为热点[2]。自从Bagley1928年首次采用狗作为蛛网膜下腔出血模型以来[3-4]，所选动物已囊括大鼠、兔、猫、猪、狗、猴等。选择大鼠建立蛛网膜下腔出血（Subarachnoid hemorrhage，SAH）模型主要原因如下：（1）大鼠的基因与人类基因同源性高；（2）大鼠蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的表现与人类类似；（3）在大鼠模型上可以进行几乎所有诱发SAH的试验；（4）大鼠繁殖能力强、易饲养且价格便宜，来源充足；因此，近年来，人们大量使用大鼠将其自体动脉血直接注入蛛网膜下腔的方法制造SAH模型[5]。endprint

Otsuji等[6]1994年对Endo的模型进行改良，第二次注血时改用氧合血红蛋白代替全血，发现动物出现的神经功能障碍更加严重，使SAH的模型更加完善。刘承基等[7-8]亦发现，SAH后急性脑血管痉挛与动脉破裂后血液成分进入蛛网膜下腔有关，血液对血管的长时间浸泡导致血管调节功能紊乱，血管收缩功能增强，同时舒张功能出现障碍，诱发血管痉挛。血液进入蛛网膜下腔后红细胞溶解，释放氧合血红蛋白，灭活NO、激活鸟苷酸环化酶，增加氧自由基的产生，最终使血管收缩，此为引起脑血管痉挛的早期关键因素。

制作大鼠SAH模型的方法多种多样，到目前为止有关大鼠SAH的造模方法主要可归纳为三类：（1）颅内动脉刺破法；（2）枕大池注血法；（3）视交叉前池或蛛网膜下腔注血法[9]。第一种方式是刺破颈内动脉颅内段某一点，血液流入蛛网膜下腔，该方法符合蛛网膜下腔出血的发病特点，但存在一定缺陷：①细线刺入血管后可能造成暂时性脑缺血，如时间超过30 min，有局部脑组织坏死的可能；②出血量不恒定，影响实验结果的观察；

③操作复杂，损伤大，死亡率较高，在蛛网膜下腔出血后24 h约50%的动物死亡；④可引起脑内出血，发生率约占全部实验动物的11%。近年来，开颅视交叉池注血法建立SAH模型报道较多[10-11]，此方法应用脑立体定位仪固定，手术暴露冠状缝、矢状缝及bregma点，在bregma点前7.5 mm稍偏右侧处钻孔后行视交叉池注血[12]。但此种方法要求仪器辅助，且操作过程复杂，需要经过专门训练才能熟练完成。后两种造模方式多为手术开颅将非抗凝自体血经额或经小脑延髓池或侧脑室插管注入蛛网膜下腔，但采用自体动脉血注入小脑延髓池的方法较多，称为枕大池注血法。Dudhani等[13]、孙保亮等[14]对单次注血法进行改良，对寰枕区域进行了更细致的解剖，穿刺注血0.15 mL，停留30 s后拔针，48 h后第二次注血0.15 mL，称为枕大池二次注血法（double hemorrhage injection），也取得了成功，此方法克服了单次注血后血管痉挛不稳定的缺点，成为目前常用的SAH造模方法。

本实验考虑到SAH大鼠模型要求模型应具有发病机制相似、操作可控性强、所有模型之间差异应尽可能小、死亡率不能太高，经过认真地探索，对动物进行局部解剖测量，找到适合的进针角度及深度，并借鉴其他学者的成功经验，采用改良枕大池二次注入自体动脉血溶血物法，共制作出72只SAH模型，死亡率为11%，分析死亡原因可能与短时间内脑池注血，延髓受压，未进行复苏支持有关。试验中采用冷冻后复溶的血液，原因在于动脉血经短暂冷冻复溶后，血清析出，红细胞裂解释放血红蛋白，更准确地模拟了临床中SAH后早期脑损伤的发病机制。

通常认为对造模后大鼠神经行为学的评价可反映模型脑损伤及后期恢复的程度，并以此判断造模是否成功[15]。实验中发现，SAH后大鼠出现轻微的认知功能障碍，第3天左右会在脑干和Willis环的基底面发现凝血块，5～7 d后血凝块逐渐被吸收，在此期间死亡率约为20%[16]。Morris水迷宫（Morris Water Maze）是目前国内外研究中广泛应用的检测空间学习记忆功能最精确、客观的一种方法。测试大鼠学习、记忆功能的方法很多，而Morris水迷宫实验则最为常用，且可以通过每天变化平台的位置来增加难度[17]。

本实验显示试验组大鼠每天的隐匿平台逃避潜伏期均明显比对照组大鼠长（P<0.01），平台搜索试验中每分钟穿越原平台位置的次数明显比对照组大鼠少（P<0.01），说明缺血再灌注后大鼠空实验组大鼠与对照组相比在逃避潜伏期、平台搜索结果方面结果均差异显著，证明大鼠蛛网膜下腔注血后12～48 h学习记忆功能障碍明显，与临床SAH患者出现的相关症状类似，證明蛛网膜下腔出血后海马神经元受到损伤，Jeon等[18]猜测这可能与大脑皮层和海马内神经元的数量减少有关。结合大体解剖等观察证明：采用改良枕大池二次注入自体动脉血溶血物法可成功制作蛛网膜下腔出血大鼠模型。

在此模型制作过程中，个人体会主要有以下几点：（1）保持相对恒定的实验环境温度：10-11月份，8只大鼠在首次注血后或二次注血后死亡，此时测量动物手术室的温度多在17～19 ℃。而分析原因之后，笔者应用小动物保温毯，保持试验环境温度25～29 ℃，死亡率明显降低。因此，建议操作时实验室温度维持在25℃以上。（2）注血量及时间：注血量超过0.3 mL则因颅内压过高导致动物死亡；而注血量在0.2 mL以下（包括0.2 mL）时，颅底血液沉积不足，极少产生脑血管痉挛，不足以造成明确的脑损伤；注血时间要控制在5 min左右，注血过快可导致枕骨大孔疝形成。（3）进针时不能太深，应用自制的穿刺针，刺破硬膜时突破感明显，可更好把握进针深度，损伤脑干的机率大大减少。（4）股动脉取血后，迅速置于-80 ℃深低温冰箱冷冻10 min，37 ℃复溶。（5）操作过程中严格无菌操作，预防颅内感染。

综上所述，采用非开颅枕大池二次注入自体动脉血溶血物法建立蛛网膜下腔出血大鼠模型，操作简易，可重复性强，动物行为活动改变、神经功能受损明显，成功模拟临床上动脉瘤性蛛网膜下腔出血的病理生理过程。

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（收稿日期：2017-02-13） （本文編辑：周亚杰）endprint