4种冠心病气虚血瘀证大鼠模型建立方法的比较

黄烁　刘建勋　李磊　杨斌　许晴　王琼

[摘要] 对单纯结扎冠状动脉、控制饮食复合结扎冠状动脉、疲劳跑步复合结扎冠状动脉、控制饮食+疲劳跑步双因素复合结扎冠状动脉4种方法建立的冠心病气虚血瘀证病证结合大鼠模型进行比较。该实验选用Wistar雄性大鼠，随机分为假手术组（SHAM）、单纯结扎冠脉组（L）、控制饮食复合结扎冠状动脉组（DL）、疲劳跑步复合结扎冠状动脉组（EL）、控制饮食+疲劳跑步双因素复合结扎冠脉组（DEL）。L组进行单纯冠脉结扎；DL组通过2周控制饮食造成脾胃气虚为主的全身气虚大鼠模型，在此基础上结扎冠脉，术后继续控制饮食；EL组通过2周跑台运动造成大鼠全身气虚模型，在此基础上进行冠脉结扎，术后以1次/2 d的频率维持力竭跑步；DEL组通过2周控制饮食、跑台运动造成大鼠全身气虚模型，在此基础上进行冠脉结扎，术后继续控制饮食并以1次/2 d的频率维持力竭跑步；于术后4周观察大鼠宏观体征，分别采集大鼠超声心动检测指标、呼吸幅度对大鼠冠心病气虚血瘀证的主症进行评价；采集空场实验相关指标、力竭运动时间、足底图像色彩饱和度对兼症进行评价；采集舌面色彩饱和度对舌象进行评价；采集脉搏搏动幅度对脉象进行评价。同时对脑钠肽、内皮素等指标进行检测。结果显示术后4周，通过疲劳运动复合结扎冠脉方法建立的模型与其他3种方法建立的模型比较与临床病因学基础以及与中医相关理论体系的联系更密切，在完整体现中医证候的特征方面具有一定的优势，更符合临床实际发病的原因与特征，是一种条件可控、重复性好的冠心病气虚血瘀证病证结合大鼠模型。

[关键词] 冠心病； 病证结合； 气虚血瘀证； 动物模型

Comparison of 4 types of coronary heart disease model of

Qideficiency and bloodstasis syndrome in rats

HUANG Shuo1， LIU Jianxun1*， LI Lei1， YANG Bin1， XU Qing2， WANG Qiong3

（1. Institute of Basic Medical Sciences of Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences，

Beijing Key Laboratory of Pharmacology of Chinese Materia Medica， Beijing 100091， China；

2. Core Facilities for Electrophysiology， Core Facilities Center， Capital Medical University， Beijing 100069， China；

3. Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Science and Peking Union

Medical College， Beijing 100193， China）

[Abstract] This paper was aimed to establish a method for coronary heart disease in rats with Qideficiency and blood stasis of the stable by comparing different model establishment methods （L group： ligation of coronary artery， EL group： exercise fatigue combine ligation of coronary artery， DL group： diet combine ligation of coronary artery， DEL group： diet， exercise fatigue combine ligation of coronary artery）. After 6 weeks postoperatively， both the method of L （ligation of coronary artery） and DL， EL， DEL （multioriginated information complex） could be successfully established by coronary heart disease model of Qideficiency and bloodstasis syndrome type in rats. Model set up by using the compound factors （DL， EL， DEL）， and through simple ligation of coronary artery to build model （L） to compare the clinical etiology and linked， DL， EL and DEL were more closely with relevant theoretical system of traditional Chinese medicine （TCM） and have a certain advantage in complete reflect the characteristics of TCM syndrome. Among three kinds of compound factors model， EL model compared with other two models DL and DEL was more consistent with clinical practical reasons and characteristics of the disease. Through EL the CHD deficiency of blood stasis rat model of combined disease could be controlled and good repeated.

[Key words] coronary heart disease； diseasesyndrome combination； Qideficiency and bloodstasis； animal model

doi：10.4268/cjcmm20162222

冠心病（coronary heart disease，CHD）是冠状动脉粥样硬化性心脏病的简称，亦称为缺血性心脏病。心血管疾病是目前导致人类死亡与残疾的三大主要疾病之首，严重危害人类健康。祖国医学虽无冠心病的病名，但根据症状多属于中医学的“胸痹”、“真心痛”、“厥心痛”等范畴。冠心病中医证型按虚实均可归为本虚标实、本虚和标实三大类。本虚标实属常见证型，近年我国人民生活方式的改变导致气虚、血瘀2种证候要素在冠心病证候要素中所占比例逐渐升高。

目前对于冠心病气虚血瘀证动物模型的研究已经有了一些进展，但在造模方法以及模型评价体系上仍然不够成熟与临床差距较大，尚无公认的标准的规范化的模型建立和评价方法。本文依据中医对冠心病气虚血瘀证的病机认识，在既往实验研究的基础之上，通过比较4种模型建立方法尝试得出一种稳定性高、重复性好的动物模型。

1 材料

正常雄性Wistar大鼠124只，体重（100±10） g，清洁级，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可编号SCXK（京）20120001。

高分辨率小动物超声影像系统Vevo 2100（加拿大VisualSonics公司探头型号MS250）；MouseOx小动物无创脉搏血氧仪（美国Starr Life Sciences Inc公司）；NikonD90单反相机；台湾TES1330A数位式照度计；中国航天员训练中心和中国医学科学院药用植物研究所联合研制开发的空场计算机图像实时监测分析系统； LHPT动物实验跑台（安徽正华生物仪器设备有限公司）； VIP3000小动物麻醉机（美国Matrx）； MS352型酶标仪（芬兰LabsystemsMultiskan）； AC8型洗板机（芬兰Thermo Labsystems）。

脑钠肽（BNP）含量检测试剂盒（北京安迪华泰科技有限公司，生产批号HTLN30415）；N端脑钠肽前体（NTproBNP）含量检测试剂盒（北京安迪华泰科技有限公司，生产批号HTLN30413）；内皮素（ET）含量检测试剂盒（北京安迪华泰科技有限公司，生产批号HTLC30315）；一氧化氮（NO）含量检测试剂盒（北京安迪华泰科技有限公司，生产批号HTLC30168）；血栓素B2（TXB2）含量检测试剂盒（北京安迪华泰科技有限公司，生产批号HTLC30156）；6酮前列腺素F1α（6ketoprostaglandin F1 alpha）含量检测试剂盒（北京安迪华泰科技有限公司，生产批号HTLN04206）。

异氟烷（100 mL/瓶，鲁南贝特制药有限公司，批号H20020267）；注射用青霉素钠（400万U/支，华北制药股份有限公司，批号F5128506）；盐酸利多卡因注射液（5 mL，0.1 g/支，中国大冢制药有限公司，批号5J88J1）。

2 方法

2.1 分组

实验大鼠饲养于中国中医科学院西苑医院SPF级实验动物中心，饲养条件：温度22～25 ℃，湿度40%～55%，大鼠随意饮食饮水。大鼠适应性喂养1 d后，进行2 d的适应性跑台训练，每天1次，每次15～30 min。当大鼠能够以20 m·min-1持续跑30 min，开始进行模型的建立。淘汰不能完成上述运动的大鼠[1]。将动物随机分成6组：A.空白组（CON，n=8）；B.假手术组（SHAM，n=8）；C.单纯结扎冠脉模型组（L，n=8）；D.多因素复合模型组，d1.疲劳运动复合结扎冠脉模型组（EL，n=15），d2.控食复合结扎冠脉模型组（DL，n=15），d3.控食、疲劳运动双因素复合结扎冠脉模型组（DEL，n=15）。

2.2 模型制备

2.2.1 心肌梗死造模方法 参照文献[2]方法，大鼠用小动物麻醉机维持麻醉状态（氧气压强0.1 MPa，氧气流量300 mL·min-1，麻醉药物浓度2%）。用止血钳撑开大鼠左侧第3，4肋间隙，轻微按压胸廓挤出心脏，用0号手术线结扎左冠脉前降支根部，结扎后心脏表面立刻给予利多卡因注射液2～3滴，立即将心脏放回胸腔，排出进入胸腔空气，缝合皮肤。关胸后立刻注射青霉素0.1～0.2 mL。假手术组只穿线不结扎，其余步骤同手术组。

2.2.2 大鼠运动疲劳模型建立方法 参考文献[34]使大鼠在跑台水平状态中进行每天1次为期2周中等强度的跑步运动，造模实验方案见表1。

2.2.3 大鼠控制饮食方法 参考文献[56]和前期预实验经验，给予大鼠每天正常进食量的1/2（约为13 g·d-1），不限制饮水。

2.2.4 术后疲劳运动方法 手术恢复3 d后开始让大鼠进行力竭运动（速度20 m·min-1，频率1次/2 d）。

2.3 疾病特征的评价

2.3.1 超声心动图检测 6周造模结束后利用异氟烷维持大鼠麻醉状态后[维持大鼠心率在（350±20） bpm]，对大鼠胸部左侧锁骨至肋骨下缘进行备皮处理。在左室长轴及胸骨旁短轴各切面进行二维扫查，选用左室短轴切面M超测量计算左室收缩末内径（LVID；s），左室舒张末内径（LVID；d），左室收缩末容积（LV Vol；s），左室舒张末容积（LV Vol；d），射血分数（EF），短轴缩短率（FS），各项指标均连续测量5个周期，取平均值。

2.3.2 生物学标志物脑钠肽（BNP）和N端脑钠肽前体（NTproBNP）含量测

定 6周造模结束后在大鼠麻醉状态下进行腹主动脉取血，血液室温放置20 min，1 800×g离心20 min，取上层血清备用。采用ELISA方法测定各组大鼠血清中BNP和NTproBNP含量。

2.4 证候评价

收集模型的四诊信息，参照临床证候评价标准，从模型的宏观表现、疾病信息以及实验室指标等多角度对模型进行证候评价，增加了模型的可信度，从而避免了对模型进行主观认证的缺陷。参照《中药、天然药物药治疗冠心病心绞痛的临床研究指导原则》（2002年版）， 气虚血瘀证中医证候诊断标准：胸痛胸闷，心悸气短，身倦乏力，面色紫暗，舌淡紫，弱脉而涩。同时考虑到动物本身特点，制定大鼠冠心病气虚血瘀证中医证候诊断标准。

2.4.1 一般状态观察（毛发、精神状态、体重等） 6周造模结束后在安静环境下对动物进行观察测量。

2.4.2 主症（胸痛胸闷、心悸气短） 超声心动图指标包括射血分数（EF）、短轴缩短率（FS）、呼吸幅度。超声心动图检测方法同2.3.1项。呼吸幅度测定方法：6周造模结束后利用2%异氟烷维持大鼠麻醉状态后，利用MouseOx小动物无创脉搏血氧仪对大鼠呼吸幅度进行检测。记录每只动物连续30个有效数据，取平均值。

2.4.3 兼症（身倦乏力、面色紫暗） 大鼠空场实验相关指标检测：6周造模结束后进行，空场实验室保持安静，室内暗光，实验人员位置以操作角度无法观测到箱中实验动物为准。空场测试箱直径80 cm，高50 cm，内壁与底部涂黑。实验前，将动物在测定房间中适应10 min。实验开始时捏住大鼠尾巴距根部1/2处放入测试箱底部中心，显示器中观察动物10 min内活动情况，每次测定结束后将动物排泄物清理干净，并用酒精擦拭箱底驱散气味。实验结束后利用软件进行录像分析。描绘动物运动轨迹，测量动物运动距离、平均速度、运动时间。

力竭运动时间测定：6周造模结束后将大鼠放进小动物实验跑台（跑台速度25 m·min-1，电击强度1.5 mA）进行力竭跑步测试。以大鼠3 s内被连续电击5次仍无法跑步为标准判断是否力竭。记录时间。

足底图像采集（统一右侧后肢足底）及色彩饱和度分析：6周造模结束后参照文献方法[7]，在动物房利用色温5500K柔光箱进行布光，根据国际照明委员会CIE推荐的标准照明和观测条件，采用45/0（照明/观察）的照明几何条件安排光路。光源照度测量采用台湾泰仕TES1330A 照度计，舌面处照度范围控制在1 500～2 000 lx（勒克斯）。图片采集应用尼康D90数码单镜反光相机，联合尼康AFS微距尼克尔60 mm f/2.8GED镜头，相机用三脚架固定，镜头与足底距离15 cm。应用灰卡手动设定白平衡，图像采集时选用相机手动（M）档，自动对焦，以光圈F8，快门1/80 s，ISO 400 的条件采集足底图像。拍照时保证比色卡与足底在同一平面，足底照片以JPG格式输出。图像采集后利用Adobe Photoshop CS5软件选取足底区域3点，读取像素区域R（红色）、G（绿色）及B（蓝色）分量值。

2.4.4 舌象（舌淡紫） 舌面色泽深浅（RGB值）舌面图像采集及色彩饱和度分析方法同足底采集分析方法。

2.4.5 脉象（弱脉而涩） 脉搏幅度测定方法：6周造模结束后利用2%异氟烷维持大鼠麻醉状态后，利用MouseOx小动物无创脉搏血氧仪对大鼠脉搏幅度进行检测。记录每只动物连续30个有效数据，取平均值。

2.5 生物学相关指标评价

内皮素（ET）、一氧化氮（NO）、血栓素B2（TXB2）、6酮前列腺素F1α（6ketoPGF1α）含量测定：采用ELISA方法对各组大鼠血清中上述指标含量进行测定，操作方法按照试剂盒说明书进行。

2.6 心肌病理组织检查

2.6.1 大鼠心肌MASSON染色 心脏切片脱蜡至水，经过天青石蓝，Mayer 氏苏木素，丽春红苦味酸，1% 淡绿等染色后，再脱水，树胶封固。显微镜下观察，胶原纤维染为蓝色，胞核染为蓝黑色，肌纤维染为红色。

2.6.2 大鼠心肌HE染色 大鼠心肌组织放于4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，切片（5 μm），苏木精伊红染色，光学显微镜下观察心肌结构。

2.6.3 电镜观察 取大鼠心肌梗死部位，以电镜液固定，电镜下观察线粒体超微结构病理变化。

2.7 统计方法

统计软件采用SPSS 20.0进行统计。实验获得的各数据以±s表示。若数据符合正态分布方差齐用LSD检验，反之用Tamhane′s T2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 一般状态变化情况

6周造模结束后，除CON和SHAM以外，其余各组大鼠精神萎靡，被毛枯黄失去光泽，活动度降低，喜欢聚拢在一起，嗜睡，对外界刺激反应迟钝，稀便，大鼠鼻尖、口唇、掌心、舌面与SHAM比较，均发生不同程度的变紫变暗；SHAM体重与CON比较未见统计学意义。 DL，EL，DEL与SHAM比较体重显著下降（P<0.01），L与SHAM比较体重下降但未见统计学意义； DL，EL，DEL与L比较体重显著下降（P<0.05，P<0.01），见表2。

3.2 大鼠超声心动图检测

3.2.1 射血分数、短轴缩短率 6周造模结束后，SHAM射血分数、短轴缩短率与CON比较未见统计学意义；DL，EL，DEL，L与SHAM比较射血分数、短轴缩短率显著下降（P<0.01），DL，DEL与L比较短轴缩短率显著下降（P<0.01），EL与L比较短轴缩短率下降但未见统计学意义，DL，EL，DEL与L比较射血分数显著下降（P<0.05，P<0.01），见表3。

3.2.2 左室舒张（和收缩）末内径 6周造模结束后，SHAM左室舒张（和收缩）末内径与CON比较未见统计学意义；DL，EL，DEL，L与SHAM比较左室舒张末内径、左室收缩末内径显著扩大（P<0.01）；DL，EL，DEL与L比较左室舒张末内径、左室收缩末内径显著扩大（P<0.05，P<0.01），见表3。

3.2.3 左室舒张（和收缩） 末容积 6周造模结束后，SHAM左室舒张（和收缩）末容积与CON比较未见统计学意义；DL，EL，DEL，L与SHAM比较左室舒张末容积、左室收缩末容积显著扩张（P<0.01）；DL，EL，DEL与L比较左室舒张末容积显著扩张（P<0.05，P<0.01），左室收缩末容积扩张但均未见统计学意义，见表3。

3.3 大鼠呼吸幅度检测

6周造模结束后，SHAM呼吸幅度与CON比较未见统计学意义；DL，EL，DEL，L与SHAM比较，呼吸幅度显著下降（P<0.01）；DL，EL，DEL与L比较，呼吸幅度显著下降（P<0.01），见表4。

3.4 大鼠空场实验相关指标检测

3.4.1 平均速度 6周造模结束后，SHAM平均速度与CON比较未见统计学意义；DL，DEL与SHAM比较，平均速度显著下降（P<0.05）；EL，L与SHAM比较，平均速度下降但均未见统计学意义；DL，DEL与L比较，平均速度下降但均未见统计学意义，EL与L比较，平均速度上升但未见统计学意义，见表5。

3.4.2 运动路程 6周造模结束后，SHAM运动路程与CON比较未见统计学意义；DL，DEL与SHAM比较，运动路程显著下降（P<0.05）；EL，L与SHAM比较，运动路程下降但均未见统计学意义；DL，DEL与L比较，运动路程下降但均未见统计学意义，EL与L比较，运动路程上升但未见统计学意义，见表5。

3.4.3 运动时间 6周造模结束后，SHAM运动时间与CON比较未见统计学意义；DEL与SHAM比较，运动时间显著下降（P<0.01）； DL，EL，L与SHAM比较，运动时间下降但均未见统计学意义； DL，EL，DEL与L比较运动时间下降但均未见统计学意义，见表5。

3.5 大鼠力竭运动时间检测

6周造模结束后，SHAM力竭运动时间与CON比较未见统计学意义；DL，EL，DEL，L与SHAM比较力竭运动时间显著下降（P<0.01）；DL，DEL与L比较力竭运动时间显著下降（P<0.01），EL与L比较力竭运动时间下降但未见统计学意义，见表6。

3.6 大鼠足底图片分析

6周造模结束后，SHAM足底色彩饱和度与CON比较未见统计学意义；DL，EL，DEL，L与SHAM比较，足底R，G，B值显著下降（P<0.01）；

DL与L比较足底R值显著下降（P<0.05），足底G值下降但未见统计学意义； EL与L比较足底R，G值下降但均未见统计学意义；DEL与L比较足底R，G值显著下降（P<0.01），B值下降但未见统计学意义，见表7。

3.7 大鼠舌面图片分析

6周造模结束后，SHAM舌面色彩饱和度与CON比较未见统计学意义；DL，EL，DEL，L与SHAM比较，舌面R，G，B值显著下降（P<0.01，P<0.05）； DL与L比较，舌面R，G值下降但均未见统计学意义； EL与L比较，舌面G，B值下降但均未见统计学意义； DEL与L比较，舌面R，G，B值显著下降（P<0.01，P<0.05），见表8。

3.8 大鼠脉搏幅度检测

6周造模结束后，SHAM脉搏幅度与CON比较未见统计学意义；DL，EL，DEL，L与SHAM比较，脉搏幅度显著下降（P<0.01）；DL，EL，DEL与L比较，脉搏幅度显著下降（P<0.01），见表9。

3.9 血清脑钠肽检测

6周造模结束后，SHAM血清BNP含量与CON比较未见统计学意义；DL，EL，DEL，L与SHAM比较，血清BNP含量显著升高（P<0.01）； DL，EL，DEL与L比较，血清BNP含量显著升高（P<0.01），见表10。

3.10 血清N端脑钠肽前体检测

6周造模结束后，SHAM血清NTproBNP含量与CON比较未见统计学意义；DL，EL，DEL，L与SHAM比较，血清NTproBNP含量显著升高（P<0.01）；DL，DEL与L比较，血清NTproBNP含量显著降低（P<0.01），EL与L比较，血清NTproBNP含量上升但是不存在统计学意义，见表11。

3.11 血清内皮素检测

6周造模结束后，SHAM血清ET含量与CON比较未见统计学意义；DL，EL，DE，L与SHAM比

3.12 血清一氧化氮检测

6周造模结束后，SHAM血清NO含量与CON比较未见统计学意义；DL，EL，DEL，L与SHAM比较，血清NO含量显著下降（P<0.01）； DL，DEL与L比较，血清NO含量显著下降（P<0.01），EL与L比较，血清NO含量上升但是不存在统计学意义，见表13。

3.13 血清6酮前列腺素F1α/血栓素B2比值

6周造模结束后，SHAM血清6KetoPGF1α/TXB2比值与CON比较未见统计学意义；DL，EL，DEL与SHAM比较，血清6KetoPGF1α/TXB2比值显著下降（P<0.05，P<0.01）；L与CON比较血清6KetoPGF1α/TXB2比值下降但未见统计学意义；DL，EL，DEL与L比较，血清6KetoPGF1α/TXB2比值显著下降（P<0.01），见表14。

3.14 心肌病理组织检查

3.14.1 心肌MASSON染色 CON，SHAM心肌染色以红色的心肌细胞为主， 心肌组织分布均匀，结构清晰，细胞排列整齐，心肌细胞间质和周围血管无明显蓝色胶原纤维；其余各模型组大鼠心肌细胞排列紊乱、肥大，大量心肌细胞被胶原纤维代替，心肌纤维化严重，见图1。

3.14.2 心肌HE染色 CON，SHAM心肌细胞形态及间质结构正常；其余各模型组大鼠心肌横纹消失，肌束断裂，大部分细胞膜不完整，胞浆混浊，间质内炎性渗出明显，心肌纤维间有大量结缔组织增生，见图2。

3.14.3 电镜观察 CON，SHAM心肌结构正常，肌丝排列有序且比较整齐；其余各模型组肌丝部分溶合，肌节排列不完整，肌纤维间大量胶原纤维增生，线粒体水肿、嵴膜溶合，见图3。

4 讨论

4.1 4种建立模型方法的比较

本研究应用4种不同的方法，探讨影响建立冠心病气虚血瘀证大鼠模型的干预因素和控制方法。结果显示单纯通过结扎冠脉方法（L）建立的模型在心脏功能、运动功能、脉搏幅度、呼吸幅度、舌面与足底色彩饱和度、血管活性物质释放均有明显的影响，使心脏结构发生改变，射血能力减弱，力竭运动时间缩短，活动能力下降，呼吸及脉搏幅度减弱，舌面与足底色彩饱和度降低，血管内皮功能发生障碍，心肌组织发生病理性改变，而对体重有影响但是不存在统计学意义。通过复合因素（DL，EL，DEL）建立的模型对上述主要指标均有更为明显的影响。利用单纯高位结扎左冠状动脉前降支建立的冠心病气虚血瘀证大鼠模型虽然在证候上表现出了心气虚证与血瘀证的相关特点比如心功能下降，运动能力变差，掌心色彩饱和度下降等。但这种模型的建立方法均与特异的病理变化关联，只能够反映临床病理表现的一个方面，缺少临床病因学基础，与中医相关理论体系缺乏联系，很难完整体现出中医证候的特征，出现的病理状态并不能够与特定的中医证候对等。相比较之下本研究利用复合因素方法建立的冠心病气虚血瘀证大鼠模型则更具有优势，模型在冠心病气虚血瘀中医证候的表现上更加显著。在3种复合因素（疲劳运动+结扎冠脉，控食+结扎冠脉，疲劳运动、控食双因素+结扎冠脉）建立模型的方法当中，虽然通过疲劳运动、控食双因素复合结扎冠脉（DEL）这种方法建立的模型与疲劳运动复合结扎冠脉（EL）、控食复合结扎冠脉（DL）这2种方法建立的模型在一些相关指标以及证候特征上比较表现更为显著，但是考虑到实验动物的耐受性有限，干预因素刺激过于强烈的时候会造成实验动物死亡，模型成活率偏低，不利于相关实验研究的展开。疲劳运动复合结扎冠脉（EL）的方法遵循中医病因病机

“血瘀多由日久气虚所致，血瘀进一步阻滞气机致虚”，先通过呈梯度递增强度的跑步运动使大鼠处于疲劳状态，模拟人体生理上呈现出的疲劳状态，正气消耗开始出现气虚证的表现；在此基础上结扎大鼠冠状动脉前降支，模拟人体心肌梗死的发生，日久气虚导致心脉瘀阻；术后维持一定强度的跑步运动，继续模拟人类正气的消耗，由心肌梗死导致心力衰竭过程的发生，伴随气虚血瘀症候的出现，与控食复合结扎冠脉（DL）的方法相比更符合临床实际发病的原因与特征。

在建立大鼠运动型疲劳状态的方法上常用的有跑台运动[8]、游泳[9]、转笼运动[10]、转棒运动[11]、旷野运动[12]、爬绳运动[13]等方法。本研究选用跑台运动主要是由于跑步是大鼠本能的一种运动方式，符合哺乳类动物的特点，而且在运动强度的控制上可以量化把握。大鼠初次在跑台上进行跑步运动时，会由于空间密闭，电流刺激出现恐慌、惊乱等情况，影响运动过程，因此在疲劳运动模型开始建立之前，要对实验动物进行适应性训练，淘汰掉不能正常完成跑步运动的大鼠。此外，在对跑台速度进行设置时，不要一次性调节到最大速度值，不然会对大鼠造成惊吓从而无法顺利完成跑步，应该使跑台速度呈梯度升高，使大鼠逐渐适应速度的提升。在采集大鼠足底和舌面图像时，需要尽量保持客观条件的稳定性，比如采集环境安静、采集时间固定、采集光源固定，控制好图像拍摄时的角度以及距离，而且在采集图像时使用标准比色卡，这样在后期对图片资料进行处理时能保证均一化。

4.2 动物疾病证候诊断研究

本研究收集模型的四诊信息，参照临床证候评价标准，从模型的宏观表现、疾病信息以及实验室指标等多角度对模型进行证候评价，增加了模型的可信度，从而避免了对模型进行主观认证的缺陷。参照《中药、天然药物药治疗冠心病心绞痛的临床研究指导原则》（2002年版）， 气虚血瘀证中医证候诊断标准：胸痛胸闷，心悸气短，身倦乏力，面色紫暗，舌淡紫，弱脉而涩；同时考虑到动物本身特点，制定大鼠冠心病气虚血瘀证中医证候诊断标准如下。主症（胸痛胸闷，心悸气短）：用反映心脏功能的超声心动图指标诊断是否胸痛胸闷；用呼吸幅度诊断是否心悸气短。兼症（身倦乏力、面色紫暗）：用反映大鼠运动能力的空场实验指标、力竭运动时间诊断是否身倦乏力；由于大鼠面部图像采集以及分析存在一定困难，而大鼠足底图像方便采集且色泽变化较为明显所以用足底图像色彩饱和度来诊断是否面色紫暗。舌象（舌淡紫）：用舌面色彩饱和度变化来诊断是否舌色淡紫。脉象（脉弱而涩）：用反映大鼠脉搏搏动强度的指标来诊断是否脉弱而涩。同时结合相关病理指标，能够对冠心病气虚血瘀证大鼠模型进行一个较为完整的疾病以及证候诊断。

本实验中通过单纯结扎冠脉方法建立的模型以及复合因素（疲劳运动+结扎冠脉，控食+结扎冠脉，疲劳运动、控食双因素+结扎冠脉）方法建立的模型与空白组对比射血分数、短轴缩短率显著下降，呼吸幅度减弱体现了主症（胸痛胸闷，心悸气短）的出现；空场相关指标发生改变、力竭运动时间缩短、足底色彩饱和度降低体现了兼症（身倦乏力、面色紫暗）的出现；舌面色彩饱和度降低体现了舌象（舌淡紫）的改变；脉搏搏动强度减弱则体现了脉象（脉弱而涩）的改变。说明以上4种方法建立的模型能够在建模开始6周后辨证为气虚血瘀证。

在动物疾病诊断时对脑钠钛和N端脑钠钛前体进行检测[1415]，是因为脑钠钛是心力衰竭的病理生理的重要调节因子，对心力衰竭诊断及预后评估有很高价值。近年发现N端脑钠钛前体在心力衰竭无症状阶段已开始升高，血清浓度比脑钠钛高，是评价心力衰竭患者预后的一个独立因素。有研究表明，心力衰竭的发生与一氧化氮的代谢紊乱有关[16]，而内皮素在诱发和加重心力衰竭过程中起着重要作用[1718]。由于大鼠与人存在着种属差异，临床有关病证的特异性指标未必能在动物身上完全重现，因此在病证确定的前提下，探索大鼠专属性的病证指标对于建立一种特异性模型具有重要的意义，在之后的实验中将会着重进行研究。

[参考文献]

[1] 刘晓莉，罗勇，乔德才. 大鼠一次性力竭跑台运动模型的建立及动态评价[J]. 中国实验动物学报，2012（3）：25.

[2] 黄烁，任建勋，王少辰，等.冠心病气虚血瘀证大鼠模型的建立[J].中国中药杂志，2016， 41（9）：1699.

[3] 汶希，潘华山，冯毅翀. 大鼠运动性疲劳模型的建立[J]. 中国实验动物学报，2009（5）：368.

[4] Bedford T G， Tipton C M， Wilson N C， et al. Maximal oxygen consumption of rats and its changes with various experimental produces[J].J Appl Physiol， 1979， 7：1278.

[5] 肖成荣，谭洪玲，马增春，等. Wistar大鼠二年喂养对其生存、体质量、进食量及自发性肿瘤发生率的观察与分析[J]. 实验动物科学，2014（1）：34.

[6] 陈巍，侯粉霞，杨慧芳. 两年喂饲试验中Wistar大鼠的摄食量[J]. 中国比较医学杂志，2013（11）：18.

[7] 李磊，林成仁，任建勋，等. 小型猪痰瘀互结证冠心病证侯诊断研究[J]. 世界中医药，2013（10）：1132.

[8] 宋李亚，石君杰，梅诗雪，等. 仙鹤草对抗大鼠运动性疲劳的实验研究[J]. 现代中西医结合杂志，2011（35）：4481.

[9] 杨涛，黄庆愿. 低压舱内大鼠游泳运动模型的建立[J]. 高原医学杂志，2012（1）：4.

[10] 张世明，叶锐彬，虞亚明，等. 运动性疲劳的中医分型和诊断标准的研究[J]. 中国运动医学杂志，2003（1）：47.

[11] 杨则宜. 运动营养生物化学研究进展[J]. 中国运动医学杂志，2004（2）：158.

[12] 陈奇.中药药理研究方法学[M].北京：人民卫生出版社，2006：513.

[13] 谢伟，杨永亮，郑红英. 银杏叶提取物对小鼠抗运动性疲劳能力影响的实验研究[J]. 山东体育学院学报，2004（5）：51.

[14] 蔡大炜. 脑钠肽、内皮素和超敏C反应蛋白检测在心力衰竭患者中的应用[J]. 中华全科医学，2014（1）：70.

[15] 李建珍，刘春江，府伟灵. 脑钠肽在慢性心力衰竭中的应用[J]. 国际检验医学杂志，2014（11）：1458.

[16] D Querleu，E Leblanc，B Castelain. Nitric oxide inhibits the positive inotropic response to betaadrenergic stimulation in humans with left ventricular dysfunction[J].Circulation， 1995， 92（8）：2198.

[17] Hilal Dandan R， Ramirez M T， Villegas S， et al. Endothelin ETA receptor regulates signaling and ANF gene expression via multiple G proteinlinked pathways[J].Am J Physiol， 1997， 272（1Pt2）：H130.

[18] P Sventek，A Turgeon，E L Schiffrin. Vascular endothelin1 gene expression and effect on blood pressure of chronic ETA endothelin receptor antagonism after nitric oxide synthase inhibition with LNAME in normal rats[J].Circulation， 1997， 95（1）：240.

[责任编辑 张燕]