汉防己乙素对人肺癌95D细胞凋亡的诱导作用及机制

于有江 ，罗雪，叶记林，苏兰娣，彭建明

(扬州市职业大学医学院，江苏扬州 225009)

汉防己乙素对人肺癌95D细胞凋亡的诱导作用及机制

于有江 ，罗雪，叶记林，苏兰娣，彭建明

(扬州市职业大学医学院，江苏扬州 225009)

目的观察汉防己乙素对人肺癌95D细胞凋亡的诱导作用，并探讨其可能的作用机制。方法取人肺癌95D细胞分为4组，实验1、2、3组分别加入8、16、32 μmol/L的汉防己乙素，溶剂对照组加入等体积0.1%的DMSO。采用流式细胞仪测算各组细胞凋亡率，H2DCF-DA法测定细胞内活性氧(ROS)水平，Caspase-3活性测定试剂盒检测Caspase-3活性，半定量RT-PCR法检测BCL-2、BAX mRNA。结果实验1、2、3组及溶剂对照组细胞凋亡率分别为6.71%±1.26%、17.07%±1.88%、25.78%±0.44%、5.41%±1.40%，ROS水平分别为117.7%±5.5%、151.0%±4.6%、212.0%±5.6%、100.0%±0.0%,Caspase-3活性分别为119.3%±5.7%、175.0%±13.1%、251.3%±17.0%、100.0%±3.0%，BCL-2 mRNA相对表达量分别为0.93±0.02、0.75±0.04、0.61±0.04、1.00±0.03，BAX mRNA相对表达量分别为1.10±0.02、1.63±0.04、1.85±0.04、1.00±0.02，实验1、2、3组与溶剂对照组相比P<0.05或<0.01。结论汉防己乙素可诱导人肺癌95D细胞凋亡，这可能是通过升高细胞内ROS水平、活化Caspase-3、激活BAX、抑制BCL-2实现的。

肺肿瘤；汉防己乙素；细胞凋亡；活性氧；半胱氨酸蛋白酶3；B淋巴细胞瘤-2；BCL-2相关X蛋白

近年来，肺癌的治疗取得了较大的进展，但5年生存率仍低于10%。汉防己乙素是从中药粉防己等植物中提取的化学活性成分之一，具有降低血糖、抑制主动脉血管平滑肌细胞增殖、抗高血压和抗氧化等多种生物学功能[1,2]。近年来发现，汉防己乙素对乳腺癌、肝癌、前列腺癌、白血病等多种恶性肿瘤具有良好的抗癌效果[2～5]。但迄今为止，关于汉防己乙素在肺癌中作用的报道较少，其具体的分子机制尚不明确。细胞凋亡是抗癌药物抑制肿瘤生长的重要机制之一，活性氧(ROS)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2(BCL-2)和BCL-2相关X蛋白(BAX)在细胞凋亡中起重要作用。2016年5～``月，本研究观察了汉防己乙素对人肺癌95D细胞凋亡的诱导作用，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞来源及主要试剂 人肺癌95D细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。汉防己乙素购自上海诗丹德生物公司，纯度为98%，用二甲基亚砜(DMSO)配成200 mmol/L的贮存液。DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)为AMRESO产品；Annexin V-PI细胞凋亡检测试剂盒、ROS测定试剂盒和Caspase-3活性测定试剂盒购自上海碧云天生物技术公司。

1.2 细胞培养 将人肺癌95D细胞接种于DMEM培养液(含10%胎牛血清)，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。取对数生长期细胞用于以下实验。

1.3 汉防己乙素浓度筛选 采用MTT法观察细胞增殖能力。取对数生长期细胞，调整细胞密度为5×104/mL，接种于96孔板中，每孔100 μL。24 h后药物组加入不同浓度(2、4、8、16、24、32、48、64 μmol/L)的汉防己乙素，溶剂对照组加等体积0.1%的DMSO，同时设不加细胞只加培养液的孔为空白对照。终止培养前4 h每孔加入10 μL MTT。培养4 h后，吸弃上清，每孔加入100 μL DMSO溶解反应产物，在酶标仪上检测492 nm时的OD值。细胞存活率=(药物组OD值-空白对照OD值)/(溶剂对照组OD值-空白对照OD值)×100%。2、4、8、16、24、32、48、64 μmol/L汉防己乙素处理人肺癌95D细胞存活率分别为94.8%±2.4%、86.3%±0.2%、71.7%±0.8%、61.2%±1.4%、38.5%±1.6%、19.5%±2.4%、15.2%±3.5%、13.2%±3.1%，取8、16、32 μmol/L的汉防己乙素进行下述实验以便于观察细胞凋亡情况。

1.4 细胞凋亡率测算 取对数生长期细胞，调整细胞密度为1×105/mL，接种于6孔板中，每孔3 mL。实验1、2、3组24 h后加入不同浓度(8、16、32 μmol/L)的汉防己乙素，溶剂对照组加等体积0.1%的DMSO。48 h后，将各组细胞用胰酶消化，离心收集细胞，PBS洗涤2次后用500 μL Binding buffer重悬细胞，并先后加入Annexin V和碘化丙啶(PI)轻轻混匀。室温避光孵育15 min后，采用流式细胞仪检测，计算细胞凋亡率。

1.5 细胞内ROS水平检测 细胞处理方法同1.4。48 h后，将各组细胞用胰酶消化，离心收集细胞，PBS洗涤后加入H2DCF-DA荧光探针至终浓度为10 μmol/L，在37 ℃下避光孵育30 min，采用流式细胞仪测定细胞内ROS的变化。

1.6 细胞Caspase-3活性检测 取对数生长期细胞，调整细胞密度为1×105/mL，接种于T75培养瓶中，每瓶15 mL。实验1、2、3组24 h后加入不同浓度(8、16、32 μmol/L)的汉防己乙素，溶剂对照组加等体积0.1%的DMSO。48 h后，将各组细胞用胰酶消化，离心收集细胞，PBS洗涤2次后按照Caspase-3活性测定试剂盒方法进行测定。吸尽上清后，按照每200万细胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15 min。4 ℃ 16 000 r/min离心15 min。把上清转移到冰浴预冷的离心管中。设置如下反应体系：样品50 μL、检测缓冲液40 μL、2 mmol/L Ac-DEVD-pNA 10 μL，对照组加入50 μL裂解液作为对照。37 ℃孵育60～120 min后测定405 nm处的OD值。Caspase-3相对活性=实验组或溶剂对照组OD值/对照组OD值。

1.7 细胞BCL-2、BAX mRNA表达检测 采用RT-PCR法。细胞处理方法同1.4。48 h后，取实验1、2、3组和溶剂对照组细胞，用TRIzol 抽提细胞总RNA，逆转录为互补DNA(cDNA)，取适量cDNA为模板，PCR法检测。引物序列如下：BCL-2上游引物为5′-GGTCGCCAGGACCTCGCCGC-3′，下游引物为5′-AGTCGTCGCCGGCCTGGCG-3′；BAX上游引物为5′-GAGCTGCAGAGGATGATTGC-3′，下游引物为5′-AGCCCAACAGCCGCTCCCGG-3′；GAPDH上游引物为5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′，下游引物为5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。采用Quantity One 软件进行分析，以GAPDH条带为内参，对目的条带(BCL-2和BAX)的光密度值进行半定量分析，进而得到其相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞凋亡率比较 实验1、2、3组细胞凋亡率分别为6.71%±1.26%、17.07%±1.88%、25.78%±0.44%，与溶剂对照组(5.41%±1.40%)相比P<0.05或<0.01。

2.2 各组细胞内ROS水平比较 实验1、2、3组细胞内ROS水平分别为117.7%±5.5%、151.0%±4.6%、212.0%±5.6%，与溶剂对照组(100.0%±0.0%)相比P均<0.01。

2.3 各组细胞Caspase-3活性比较 实验1、2、3组细胞Caspase-3活性分别为119.3%±5.7%、175.0%±13.1%、251.3%±17.0%，与溶剂对照组(100.0%±3.0%)相比P<0.05或<0.01。

2.4 各组细胞BCL-2、BAX mRNA表达比较 见表1。

表1 各组细胞BCL-2、BAX mRNA表达比较

注：与溶剂对照组相比，*P<0.05，#P<0.01。

3 讨论

汉防己乙素对多种恶性肿瘤具有较好的抑制作用，如肝癌、前列腺癌、白血病以及乳腺癌等，作用机制包括诱导细胞周期阻滞、促进细胞凋亡、抑制细胞迁移和侵袭等[1～3]。然而，汉防己乙素在肺癌中的作用研究较少。本研究结果发现，实验1、2、3组人肺癌95D细胞较溶剂对照组凋亡率高，表明汉防己乙素能有效地诱导肿瘤细胞凋亡。

诱导肿瘤细胞凋亡是现代抗癌药物研究的一个重要分支[6,7]。多数临床使用的抗癌药物能够通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤细胞增殖[8]。ROS能够介导多种细胞内的信号通路信号传递[9,10]，还参与脂质过氧化过程，并能介导连接硫醇基类的蛋白。本研究结果发现，实验1、2、3组细胞内ROS水平较溶剂对照组高，表明汉防己乙素能升高人肺癌95D细胞内的ROS水平。ROS产生过多能导致氧化应激、细胞功能失常、线粒体通透性转换孔开放，进一步引起细胞凋亡。可见ROS在汉防己乙素引起的肿瘤细胞凋亡中起重要作用。但汉防己乙素通过何种途径升高ROS尚需要进一步研究。

Caspases是半胱氨酸蛋白酶家族蛋白，能通过控制死亡受体和线粒体通路来促进细胞凋亡。Caspases蛋白平常以失活的酶原形式存在，在细胞凋亡中则以活化的酶形式存在。Caspase-3是Caspases家族蛋白中主要的蛋白酶之一，能够催化多种主要的细胞内蛋白的特异性剪切。BCL-2和BAX分别是BCL-2家族中最有代表性的抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。在凋亡发生过程中，BAX在某些凋亡相关因素的激活下，促进细胞线粒体内的细胞色素C释放到胞质，通过级联反应最终导致细胞凋亡。本研究结果发现，与溶剂对照组相比，实验1、2、3组细胞Caspase-3活性高，BAX mRNA表达高，BCL-2 mRNA表达低。提示汉防己乙素可通过诱导Caspase-3的活化和BCL-2/BAX失衡，进而促发细胞凋亡。

综上所述，汉防己乙素可诱导人肺癌95D细胞凋亡，这可能是通过升高细胞内ROS水平、活化Caspase-3、激活BAX、抑制BCL-2实现的。

[1] Guo B, Xie P, Su J, et al. Fangchinoline suppresses the growth and invasion of human glioblastoma cells by inhibiting the kinase activity of Akt and Akt-mediated signaling cascades[J]. Tumour Biol, 2016,37(2):2709-2719.

[2] Li D, Lu Y, Sun P, et al. Inhibition on proteasome beta1 subunit might contribute to the anti-cancer effects of fangchinoline in human prostate cancer cells[J]. PLoS One, 2015,10(10):e0141681.

[3] Xing Z, Zhang Y, Zhang X, et al. Fangchinoline induces G1 arrest in breast cancer cells through cell-cycle regulation[J]. Phytother Res, 2013,27(12):1790-1794.

[4] Guo B, Su J, Zhang T, et al. Fangchinoline as a kinase inhibitor targets FAK and suppresses FAK-mediated signaling pathway in A549[J]. J Drug Target, 2015,23(3):266-274.

[5] Wang CD, Yuan CF, Bu YQ, et al. Fangchinoline inhibits cell proliferation via Akt/GSK-3beta/ cyclin D1 signaling and induces apoptosis in MDA-MB-231 breast cancer cells[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2014,15(2):769-773.

[6] 赵林,吴鹏,章平贵,等.雷公藤甲素对人结肠癌HCT116细胞增殖、自噬和凋亡的影响[J].中国药理学通报,2016,32(10):1399-1404.

[7] 郭颖,田芝瑜,符航,等.青蒿琥酯诱导人结肠癌细胞凋亡与Wnt/β-catenin信号通路的关系研究[J].中国药理学通报,2016,32(5):707-711.

[8] Zhang J, Jing X, Niu W, et al. Peroxiredoxin 1 has an anti-apoptotic role via apoptosis signal-regulating kinase 1 and p38 activation in mouse models with oral precancerous lesions[J]. Oncol Lett, 2016,12(1):413-420.

[9] Korge P, Calmettes G, John SA, et al. Reactive oxygen species production induced by pore opening in cardiac mitochondria: The role of complex Ⅲ[J]. J Biol Chem, 2017,292(24):9882-9895.

[10] 杨亚萍,汪亚帷,李梦佳,等.DSF-Cu通过影响线粒体功能和细胞骨架诱导鼻咽癌CNE-2 Z细胞凋亡[J].中国药理学通报,2016,32(9):1208-1217.

Effectoffangchinolineonproliferationofhumanlungcancer95Dcells

YUYoujiang,LUOXue,YEJilin,SULandi,PENGJianming

(MedicalCollegeofYangzhouPolytechnicCollege,Yangzhou225009,China)

ObjectiveTo investigate the inducible effect and possible mechanism of fangchinoline on apoptosis of human lung cancer 95D cells.MethodsThe human lung cancer 95D cells were divided into four groups: experimental groups 1, 2, 3, and the control group. The cells in the experimental groups 1, 2, and 3 were added with 8, 16, and 32 μmol/L fangchinoline, respectively. Cells in the control group were added with the same volume of 0.1% DMSO. The apoptosis was measured by flow cytometry. The levels of cellular reactive oxygen species (ROS) and Caspase-3 activity were detected by H2DCF-DA and Caspase-3 activity assay. The BCL-2 and BAX mRNA expression was determined by semi-quantitative RT-PCR.ResultsThe apoptosis rate of the experimental groups 1, 2, 3 and control group were 6.71%±1.26%, 17.07%±1.88%, 25.78%±0.44%, and 5.41%±1.40%, respectively; the relative ROS levels of the experimental groups 1, 2, 3 and control group were 117.7%±5.5%, 151.0%±4.6%, 212.0%±5.6%, and 100.0%±0.0%, respectively; the activities of Caspase-3 of the experimental groups 1, 2, 3 and control group were 119.3%±5.7%, 175.0%±13.1%, 251.3%±17.0%, and 100.0%±3.0%, respectively; the levels of BCL-2 mRNA of the experimental groups 1, 2, 3 and control group were 0.93±0.02, 0.75±0.04, 0.61±0.04, and 1.00±0.03, respectively; the levels of BAX mRNA of the experimental groups 1, 2, 3 and control group were 1.10±0.02, 1.63±0.04, 1.85±0.04, 1.00±0.02, respectively. Significant difference was found between the the experimental groups 1, 2, 3 and the control group (P<0.05 orP<0.01).ConclusionFangchinoline may induce the apoptosis of human lung cancer 95D cells by increasing the cellular ROS, activating Caspase-3 and Bax, and inhibiting Bcl-2.

lung neoplasms; fangchinoline; apoptosis; reactive oxygen species; Caspase-3; B lymphocytoma-2; BCL-2 associated X protein

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.38.002

R730.1

A

1002-266X(2017)38-0005-03

江苏省卫生厅卫生职业技术教育科研资助项目(NJ201410)。

于有江(1963-)，男，副教授，主要研究方向为细胞凋亡、生物化学与分子生物学。E-mail： 836485572@qq.com

彭建明(1984-)，男，副教授，主要研究方向为细胞凋亡、镇痛。E-mail： shmily_peng@163.com

2017-06-29)