异钩藤碱对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠心肌细胞肥大的影响及机制

宋婷婷

(兖矿集团公司总医院，山东邹城 273500)

异钩藤碱对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠心肌细胞肥大的影响及机制

宋婷婷

(兖矿集团公司总医院，山东邹城 273500)

目的观察异钩藤碱(Iso)对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠心肌细胞肥大的影响，并探讨其机制。方法从新生SD大鼠分离出心肌细胞，将细胞分为对照组、AngⅡ组、低剂量Iso组、中剂量Iso组、高剂量Iso组，对照组正常培养，AngⅡ组用含有1 μmol/L AngⅡ的培养基培养；低剂量Iso组用含有1 μmol/L AngⅡ和0.1 μmol/L Iso的培养基培养；中剂量Iso组用含有1 μmol/L AngⅡ和1 μmol/L Iso的培养基培养；高剂量Iso组用含有1 μmol/L AngⅡ和10 μmol/L Iso的培养基培养。采用Leica Qwin V3图像分析系统测定各组心肌细胞表面积。BCA检测试剂盒测定对照组、AngⅡ组、中剂量Iso组培养12、24、48 h心肌细胞的蛋白含量；比色法检测一氧化氮合酶(NOS)活力；硝酸还原法检测一氧化氮(NO)含量；流式细胞仪检测细胞凋亡；Western blotting法检测Bcl-2、Bax、I-κB、p-NF-κB蛋白表达。结果大鼠心肌细胞表面积AngⅡ组、低剂量Iso组、中剂量Iso组、高剂量Iso组较对照组大，低剂量Iso组、中剂量Iso组、高剂量Iso组较AngⅡ组小，中剂量Iso组、高剂量Iso组较低剂量Iso组小，高剂量Iso组较中剂量Iso组小(P均<0.01)。同时间点大鼠心肌细胞蛋白含量AngⅡ组、中剂量Iso组较对照组高，中剂量Iso组较AngⅡ组低，且AngⅡ组、中剂量Iso组本组内24、48 h较12 h时高，48 h较24 h时高(P均<0.01)。大鼠心肌细胞NOS活力、NO含量、细胞凋亡率及Bax、p-NF-κB、I-κB蛋白表达AngⅡ组、中剂量Iso组较对照组高，中剂量Iso组较AngⅡ组低(P均<0.01)。大鼠心肌细胞Bcl-2蛋白表达AngⅡ组、中剂量Iso组较对照组低，中剂量Iso组较AngⅡ组高(P均<0.01)。结论Iso对AngⅡ诱导大鼠心肌细胞肥大起抑制作用，其机制与调控NF-κB信号通路，进而下调NOS活力、减少NO释放、抑制心肌细胞凋亡有关。

异钩藤碱；血管紧张素；心肌肥大；心肌细胞表面积；细胞凋亡；一氧化氮合酶；核转录因子κB

心肌肥大是引起心血管疾病患者死亡的重要原因，现已成为心血管疾病发病和死亡的独立危险因素。心肌肥厚的主要特征有心肌总蛋白的合成量增多、心肌细胞的表面积增大及心肌间质和血管结构成分改变，是心肌在长期超负荷工作条件下的一种适应性反应。研究[1,2]表明，许多生长因子和血管的活性物质参与了心肌重构及血管损伤的病理过程，在这些影响因素中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是一个主要的刺激因素，具有生长因子样作用，可直接引起心肌肥厚。异钩藤碱(Iso)和钩藤碱为同分异构体，是常用的传统中药钩藤中所含的主要生物碱。已有研究[3,4]显示，Iso能舒张血管、抗血管成纤维细胞增殖、抗炎、抑制血管平滑肌细胞增殖等多种作用，目前已用于中枢神经系统和心血管疾病的治疗。但Iso对心肌细胞肥大的影响及机制尚不清楚。因此，2015年8月～2016年7月本研究观察了Iso对AngⅡ诱导大鼠心肌细胞肥大的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂、仪器 出生1～3 d的SD大鼠8只，雌雄不限，由山东大学提供。AngⅡ购自美国Sigma公司；Iso购自广西中药研究所；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、胰酶均购自美国Gibco公司；CO2细胞培养箱购自德国Heraeus公司；BCA试剂盒、一氧化氮(NO)试剂盒、一氧化氮合酶(NOS)试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；Bcl-2、Bax、I-κB、p-NF-κB单克隆抗体及辣根过氧化物标记的二抗均购自美国Cell Signal公司；流式细胞仪购自美国BD公司；Leica Qwin V3图像分析系统购自德国Leica公司；酶标仪、PAGE凝胶电泳仪、电泳凝胶图像分析系统均购自美国Bio-Rad公司；紫外分光光度计购自北京普析仪器有限公司。

1.2 大鼠心肌细胞原代培养及分组处理 取8只新生SD大鼠，无菌条件下开胸取出心尖组织，D-Hanks洗涤3次后剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的碎块，用0.8 g/L的胰蛋白酶消化分离后，将消化完全的细胞加入含有10%小牛血清及90% DMEM细胞培养基的细胞培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养1～1.5 h。采用差速贴壁法纯化心肌细胞，非心肌细胞贴壁速度较快，首先附着在瓶底，心肌细胞在细胞悬液中，吸出细胞悬液，加入含有15% FBS、1%双抗(100 μg/mL链霉素和100 U/mL青霉素)的DMEM细胞培养基，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。培养2 d后换成含0.4%的小牛血清的培养基继续培养1 d后加入处理因素。将细胞分为对照组、AngⅡ组、低剂量Iso组、中剂量Iso组、高剂量Iso组，对照组用不含血清及Iso的DMEM培养基培养，AngⅡ组用含有1 μmol/L AngⅡ的DMEM培养基培养；低剂量Iso组用含有1 μmol/L AngⅡ和0.1 μmol/L Iso的DMEM培养基培养；中剂量Iso组用含有1 μmol/L AngⅡ和1 μmol/L Iso的DMEM培养基培养；高剂量Iso组用含有1 μmol/L AngⅡ和10 μmol/L Iso的DMEM培养基培养。

1.3 各组大鼠心肌细胞表面积测算 收集上述生长至对数期的5组心肌细胞，以4×107/L的密度接种于24孔细胞培养板中，24 h后进行HE染色，通过Leica Qwin V3图像分析系统对心肌细胞的表面积进行测定。每组随机选择7个视野，每个视野中测定10～15个心肌细胞，测定100个心肌细胞的表面积，每组实验重复3次。

1.4 各组大鼠心肌细胞蛋白含量检测 取对照组、AngⅡ组、中剂量Iso组细胞以5×108/L密度接种至24孔细胞培养板中培养12、24、48 h。吸弃细胞培养基，PBS洗涤细胞3次。加入适量的RIPA裂解液后收集细胞，用超声破碎细胞，4 ℃、1 200 r/min离心20 min，取上清。按照BCA检测试剂盒操作规定测定并计算每孔心肌细胞的蛋白含量。

1.5 各组大鼠心肌细胞NOS活力、NO含量检测 取对照组、AngⅡ组、中剂量Iso组细胞培养24 h后，比色法检测NOS活力。取100 μL细胞培养液，根据NOS试剂盒操作说明，用紫外分光光度计检测530 nm波长处的吸光度值，计算NOS活力。硝酸还原法检测NO含量。取50 μL细胞培养液，按照NO试剂盒操作说明，用酶标仪检测540 nm波长处的吸光度值，用标准曲线计算NO含量。

1.6 各组大鼠心肌细胞凋亡率测算 取生长至对数期的细胞，以4×109/L将心肌细胞接种至96孔细胞培养板中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，观察到细胞融合度达到70%～80%时，按上述对照组、AngⅡ组、中剂量Iso组方法处理细胞。37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，收集细胞，1 000 r/min离心5 min，Annexin V-FITC结合液重新悬浮细胞，避光室温孵育10 min，离心，弃上清，PI冰盒中避光孵育10 min。加400 μL缓冲液。流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 各组大鼠心肌细胞Bcl-2、Bax、p-NF-κB、I-κB蛋白表达检测 采用Western blotting法。取对照组、AngⅡ组、中剂量Iso组培养24 h心肌细胞，PBS洗涤细胞，用适量的裂解液置于冰上裂解反应30 min。收集细胞，4 ℃、14 000 r/min离心15 min，收集上清。采用BCA试剂盒测定提取的蛋白浓度。充分混匀蛋白样品和上样缓冲液后，100 ℃变性5 min。将变性蛋白加入到SDS-PAGE凝胶孔中进行电泳。电泳结束后4 ℃转膜1.5 h，5%的脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h，以1∶500稀释的Bcl-2、Bax、NF-κB、I-κB单克隆抗体作为一抗，4 ℃孵育过夜。TBST清洗后加入1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h，TBST清洗后加入ECL发光剂显影，自动凝胶成像系统采集图像。以GAPDH作为内参，分析蛋白表达水平。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌细胞表面积比较 对照组、AngⅡ组、低剂量Iso组、中剂量Iso组、高剂量Iso组大鼠心肌细胞表面积分别为(161.9±11.8)、(505.8±22.4)、(439.6±16.9)、(321.5±17.8)、(221.3±14.6)μm2，AngⅡ组、低剂量Iso组、中剂量Iso组、高剂量Iso组与对照组相比，低剂量Iso组、中剂量Iso组、高剂量Iso组与AngⅡ组相比，低剂量Iso组、中剂量Iso组、高剂量Iso组两两相比，P均<0.01。

2.2 各组大鼠心肌细胞蛋白含量比较 见表1。

表1 各组大鼠心肌细胞蛋白含量比较

注：与对照组比较，*P<0.01；与AngⅡ组比较，#P<0.01。

2.3 各组大鼠心肌细胞NOS活力及NO含量比较 对照组、AngⅡ组、中剂量Iso组大鼠心肌细胞NOS活力分别为(3.2±0.4)、(5.8±0.6)、(4.6±0.5)kU/L，NO含量分别为(4.6±0.3)、(7.2±0.5)、(5.9±0.4)μmol/L，AngⅡ组、中剂量Iso组与对照组相比，中剂量Iso组与AngⅡ组相比，P均<0.01。

2.4 各组大鼠心肌细胞凋亡率比较 对照组、AngⅡ组、中剂量Iso组大鼠心肌细胞凋亡率分别为2.28%±0.56%、21.24%±1.64%、14.35%±1.11%，AngⅡ组、中剂量Iso组与对照组相比，中剂量Iso组与AngⅡ组相比，P均<0.01。

2.5 各组大鼠心肌细胞Bcl-2、Bax、p-NF-κB、I-κB蛋白表达比较 对照组、AngⅡ组、中剂量Iso组大鼠心肌细胞Bcl-2蛋白表达分别为0.367±0.037、0.108±0.016、0.221±0.026，Bax蛋白表达分别为0.211±0.025、0.415±0.051、0.293±0.032，p-NF-κB蛋白表达分别为0.142±0.039、0.363±0.043、0.261±0.023，I-κB蛋白表达分别为0.341±0.034、0.611±0.054、0.482±0.029，AngⅡ组、中剂量Iso组与对照组相比，中剂量Iso组与AngⅡ组相比，P均<0.01。

3 讨论

心肌肥厚初期的适应性反应有益于正常心肌输出量的维持，但长期的超负荷状态则诱发心肌重构，导致心力衰竭、心肌收缩力降低、猝死等的发生，从而使心脏疾病的病死率增加[5～7]。因此，研究引起心肌肥大发生发展的因素，并寻找抑制心肌肥厚有效的药物，对于心脏疾病的治疗具有重要意义。

在心肌肥大形成的病理过程中，AngⅡ是一个重要的体液因子，可引起细胞间质的堆积及心肌细胞的肥大，从而导致心肌肥大的发生[8]。目前已有许多研究证实AngⅡ是引起心肌肥大的诱导剂[9]。本研究结果显示，大鼠心肌细胞表面积AngⅡ组、低剂量Iso组、中剂量Iso组、高剂量Iso组较对照组大，低剂量Iso组、中剂量Iso组、高剂量Iso组较AngⅡ组小，中剂量Iso组、高剂量Iso组较低剂量Iso组小，高剂量Iso组较中剂量Iso组小；同时间点大鼠心肌细胞蛋白含量AngⅡ组、中剂量Iso组较对照组高，中剂量Iso组较AngⅡ组低，且AngⅡ组、中剂量Iso组本组内24、48 h较12 h时高，48 h较24 h时高。可见，AngⅡ可引起心肌细胞表面积增大及细胞内蛋白表达增多，且不同浓度的Iso均能缓解AngⅡ诱导的心肌细胞面积的增大，呈浓度依赖性。Iso作用不同时间可降低AngⅡ诱导的心肌细胞内蛋白含量降低，呈时间依赖性。

NO是一个心血管系统的关键信号分子。已有研究[10]证实，NO和NOS参与了高血压、氧化应激、炎症、高胆固醇血症等多种心血管疾病的病理发展过程。心肌细胞在正常情况通过内皮型的NOS合成少量的NO以维持机体的生理功能，当受到细胞因子、内毒素等一些刺激因素时则促进诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达，使NO合成量增多，从而引起机体的病理过程[11,12]。本研究结果显示，大鼠心肌细胞NOS活力及NO含量AngⅡ组、中剂量Iso组较对照组高，中剂量Iso组较AngⅡ组低。可见，AngⅡ可引起NO释放增多并上调NOS表达，而Iso能降低NO释放和NOS表达。

已有研究[13]证实，心肌细胞的凋亡参与心室重塑的形成，并诱导心力衰竭的发生。原癌基因存在于各种生物体内，其中Bax有促凋亡作用，Bcl-2有抑凋亡作用，Bcl-2/Bax有决定细胞是否进入凋亡的重要作用[14,15]。有研究[16]表明，心肌细胞中的Bcl-2参与心肌细胞凋亡的调控。本研究结果显示，大鼠心肌细胞凋亡率AngⅡ组、中剂量Iso组较对照组高，中剂量Iso组较AngⅡ组低；大鼠心肌细胞Bcl-2蛋白表达AngⅡ组、中剂量Iso组较对照组低，中剂量Iso组较AngⅡ组高，Bax蛋白表达情况与之相反。可见，AngⅡ能引起心肌细胞凋亡，下调Bcl-2蛋白表达并上调Bax蛋白表达；而Iso能降低心肌细胞凋亡，使Bcl-2蛋白表达增多、Bax蛋白表达减少。

心肌肥大是心脏对神经体液刺激及生物机械牵张的一种主要反应。多种信号通路的激活参与心肌肥大反应，包括MAPK信号通路、PI3K/AKT信号通路、NF-κB信号通路等[17～19]。NF-κB是Rel蛋白家族的成员，以同型或者是异型二聚体的形成存在。NF-κB二聚体在大多数细胞中与抑制蛋白I-κB结合，以无活性的形式在胞质中存在。NF-κB参与了细胞的生长和分化、炎症、内毒素休克、免疫反应等过程[20]。NF-κB的激活可引起心肌细胞的肥大反应[21]。本研究结果显示，大鼠心肌细胞p-NF-κB、I-κB蛋白表达AngⅡ组、中剂量Iso组较对照组高，中剂量Iso组较AngⅡ组低。可见，AngⅡ可上调p-NF-κB和I-κB蛋白表达，而Iso能减弱NF-κB和I-κB蛋白表达。

综上所述，Iso对AngⅡ诱导大鼠心肌细胞肥大起抑制作用，其机制与调控NF-κB信号通路，进而下调NOS活力、减少NO释放、抑制心肌细胞凋亡有关。

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