蓝靛果鞣花酸超声波辅助提取工艺的研究

王佳宁，马永强，王 鑫，刘晓飞，2，张 宇

蓝靛果鞣花酸超声波辅助提取工艺的研究

王佳宁1，*马永强1，王 鑫1，刘晓飞1，2，张 宇1

（1.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨 150076；2.黑龙江省农业科学院食品加工研究所，黑龙江哈尔滨 150086）

以黑龙江省勃利县的蓝靛果作为材料，采取超声波辅助的方法提取蓝靛果中的鞣花酸，并以鞣花酸得率为指标，通过单因素试验和响应曲面法优化最佳提取工艺，确定了最佳的鞣花酸提取条件。结果表明，蓝靛果中的鞣花酸的最优提取条件为料液比1∶33（g∶mL），提取温度51℃，提取时间78 min，此时鞣花酸提取率为18.31%。

蓝靛果；鞣花酸；超声波辅助法；响应曲面法

蓝靛果（Lonicera caerulea L.），属蓝靛果忍冬的变种。椭圆形浆果味道，酸甜可口、营养丰富，具有较高的药用价值和保健功能，有着较大的开发潜力和广阔的发展空间[1-2]。如今，蓝靛果在国外主要分布于俄罗斯、日本及朝鲜北部等地区，国内则主要分布在东北、华北和西北等地，大、小兴安岭和长白山地区的野生资源贮量最大[3]，常生于高山林下、河岸或者沼泽灌木。

蓝靛果中富含多种氨基酸、矿物质和维生素等物质，是一种营养价值非常高的浆果，并且其果实中还富含多种生物活性物质，如酚酸类物质、黄酮类物质及花色苷类物质等[4]，具有抗氧化功能，可抗肿瘤、抗衰老、预防心血管疾病、神经性等多种慢性疾病[5-7]，具有较高的医用价值；还可以起到提高免疫力和调节血脂等作用，具有极高的药用价值，这与其含有特定的多酚类化合物有关。

鞣花酸（Ellagic acid）是一种普遍存在于复杂的自然界的酚类物质，在很多果实组织中都能找到，是一种天然的多酚二内酯。它又被称为六羟基联苯二酸二内酯，是一种没食子酸的二聚衍生物。鞣花酸具有的抗氧化和抗癌等活性，可广泛应用于食品、药品、医药等多个领域。另外，还具有凝血、抗细菌和抗病毒等作用，对人体免疫缺陷病毒也有一定的抑制作用，可抗癌变、抗诱变、抗突变[8]。

目前，鞣花酸常用的提取方法主要有3种，即溶剂浸提法、微波辅助法和超声波辅助法。其中，溶剂浸提法存在提取率低、提取时间长等问题；微波辅助法可提高提取效率，但其热效应对热不稳定的物质具有破坏作用，从而适得其反，使其提取率降低；超声波辅助提取技术是一项现代高新技术手段，目前多用于天然产物的提取，与传统提取法相比具有提取时间短、工作效率高等特点，并且可有效降低温度对热不稳定物质的影响，这与微波辅助法相比，不仅可以提高产物的品质和产量[9-13]，还有较广的应用范围。

基于上述，试验选用黑龙江省勃利县的蓝靛果作为原料，通过超声波辅助提取方法对其中的鞣花酸进行提取，通过单因素试验和响应曲面试验选取最优方案进行工艺优化研究，确定最佳的提取工艺条件，旨在完善提取方法、提高提取效率，也为蓝靛果中鞣花酸的开发和深加工及相关产品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝靛果，产自黑龙江省勃利县。

鞣花酸标准品、无水乙醇、盐酸、丙酮、蒸馏水等。

1.2 仪器与设备

FW177型中草药粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司产品；FA1104B型电子天平，上海越平科学仪器有限公司产品；KQ-250DE型数控超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司产品；722型紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司产品；TDL80-2B型高速离心机，上海安亭科学仪器厂制造产品。

1.3 材料的预处理

取速冻蓝靛果鲜果，将其平铺于干燥盘中，置于恒温干燥箱中于30℃下干燥24 h，使其失去大部分水分，调高温度至40℃，蓝靛果含水量达到8%，用中草药粉碎机打碎，备用。

1.4 标准曲线的绘制

1.4.1 对照溶液

准确称取0.010 0 g鞣花酸标准品，在搅动下，缓慢滴加4 mL浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液，待鞣花酸溶解后，用去离子水稀释，定容至100 mL作为标准溶液，待用。

1.4.2 标准溶液的光谱特性

准确吸取1.4.1中的标准溶液10 mL，加水稀释至200 mL，用紫外分光光度计在室温下测定吸光度（蒸馏水作参比）。

1.4.3 标准曲线

分别吸取1.4.1中的标准溶液1，5，10，15，20 mL于200 mL容量瓶中，加水稀释，定容至刻度线，配成质量浓度为 0.5，2.5，5.0，7.5，10.0 μg/mL对照品稀释液，并于波长357 nm处测定吸光度值，重复测定3次，取其平均值。以鞣花酸的质量浓度（ρ）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线。

1.5 鞣花酸得率的测定

利用如下公式计算鞣花酸得率（P）：

式中：m——提取的鞣花酸总质量，mg；

M——样品总质量，mg。

1.6 不同溶剂对鞣花酸提取率的影响

分别称量3份1.3中经预处理后的样品粉末1.00 g，并分别置于3个烧杯中。在温度60℃，超声波功率300 W条件下，料液比1∶30（g∶mL） 分别加入等体积的乙醇、丙酮和盐酸，提取50 min，并在转速4 000 r/min条件下离心10 min；减压抽滤，获得澄清液体，分别量取提取液0.5 mL，置于各个比色管中，加入25 mL丙酮，摇匀，测定其吸光度（357 nm），计算鞣花酸总质量并进行比较。

1.7 超声波辅助法提取鞣花酸工艺研究

根据1.6中的试验结果和相关文献，明确后续试验的提取溶剂为体积分数为80%的丙酮-水溶液。并进一步研究提取温度、超声波作用时间、料液比对超声波辅助提取蓝靛果中鞣花酸得率的影响，调节提取温度为40，50，60，70，80℃；超声时间为20，30，40，50，60 min；料液比为 1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40（g∶mL）。测定其吸光度（357 nm），并计算蓝靛果中鞣花酸得率。

1.8 响应曲面试验

在上述试验的基础上，以80%的丙酮-水溶液为提取溶剂，选取料液比（A）、提取时间（B）、提取温度（C）3个因素为自变量，以蓝靛果中鞣花酸得率为响应值（Y），根据试验设计方法进行响应面分析试验，并通过Design Expert 8.06软件对试验数据进行分析，得出蓝靛果中鞣花酸提取的最优方案。

响应面分析因素与水平设计见表1。

表1 响应面分析因素与水平设计

2 结果与分析

2.1 标准曲线

鞣花酸标准曲线见图1。

图1 鞣花酸标准曲线

此标准曲线的线性回归方程为：

Y=0.054 5X-0.000 9，R2=0.997.

证明该曲线线性关系良好，在鞣花酸含量为0～12 μg时呈线性关系，可用于计算鞣花酸的含量。

2.2 不同试剂对蓝靛果鞣花酸提取率的影响

不同试剂对蓝靛果鞣花酸提取率的影响见图2。

图2 不同试剂对蓝靛果鞣花酸提取率的影响

由图2可知，不同试剂对蓝靛果中鞣花酸提取率具有显著（p＜0.05）影响。由试验结果可看出丙酮提取鞣花酸的提取率较高，用超声提取法测得的鞣花酸提取率为16.32%，盐酸的提取效果较弱，为10.31%。通过比较3种提取剂对于蓝靛果中鞣花酸的提取率，即丙酮对于鞣花酸的提取效果最佳。而且相对于其他的溶剂而言，丙酮最不易与水解鞣质反应。因此选择丙酮作为溶剂对鞣花酸进行提取[14]。

2.3 超声辅助法单因素试验

2.3.1 料液比对蓝靛果提取率影响的结果

料液比对蓝靛果鞣花酸提取率的影响见图3。

图3 料液比对蓝靛果鞣花酸提取率的影响

由图3可知，料液比对蓝靛果中鞣花酸提取率具有显著（p＜0.05） 影响。料液比在1∶20～1∶40，鞣花酸提取率呈上升趋势，因为溶剂较多，可增加与物料的表面积接触，加快了目标物质的溶出。在料液比1∶40之后，鞣花酸提取率呈下降趋势，由于料液比的增加会溶解出更多的其他物质，这不仅浪费有机试剂还引入了杂质[15]。综合经济成本及后续进行的浓缩处理等因素的考虑，故可确定料液比单因素的最佳条件为1∶40。因此，选择料液比1∶30～1∶50，进行后续响应面优化试验。魏征等人[16]的研究结果表明，当料液比为1∶30时，利用超声波提取圆叶葡萄中鞣花酸和总酚的效果最好，此结论与试验结果相近。

图4 超声波提取温度对鞣花酸提取率的影响

2.3.2 超声波提取温度对蓝靛果鞣花酸提取率的影响超声波提取温度对鞣花酸提取率的影响见图4。由图4可知，超声波提取温度对蓝靛果中鞣花酸提取率具有显著（p＜0.05）影响。鞣花酸提取率随着超声波提取温度的升高而增加，较高的温度可以加快蓝靛果中鞣花酸的溶出速率，有利于鞣花酸的浸透、溶解[17]，鞣花酸提取率在50℃时达到峰值10.63%。继续加热后提取效果反而下降，这可能是蓝靛果中的鞣花酸的对热不稳定性，当提取温度过高时，鞣花酸的分子结构被破坏，导致其损失，使得提取率有所降低[19]。邓小莉等人[18]对石榴皮鞣花酸得率研究的结果显示，在超声波功率200 W，提取时间30 min的条件下，最适的提取温度60℃，这与试验趋势整体相同，结果接近。

2.3.3 提取时间对蓝靛果鞣花酸提取率的影响结果

提取时间对鞣花酸提取率的影响见图5。

图5 提取时间对鞣花酸提取率的影响

由图5可知，提取时间对蓝靛果中鞣花酸提取率具有显著（p＜0.05） 影响。当提取时间为20 min时，蓝靛果中鞣花酸提取率较低，这是因为提取时间较短时，鞣花酸与丙酮水溶液接触不够充分。当提取时间增加，蓝靛果中的鞣花酸提取率随之增加，并在50 min时提取率达到最大（11.00%）。随后，鞣花酸提取率随提取时间的增加而下降，可能此时的蓝靛果鞣花酸因较长时间暴露在空气中，部分已氧化分解，使其得率下降。

2.4 超声波辅助提取鞣花酸的响应面优化试验结果

2.4.1 响应模型的建立与分析

响应面分析方案及结果见表2。

响应曲面分析法是一种统计学试验设计，是从含有多个影响因素及其交互作用的系统中，寻找最佳方案的统计方法，最常被使用的是Box-Behnken设计[20]。 利用Design Expert 8.06软件对表2试验数据结果进行二次多项式回归拟合分析，得到蓝靛果中鞣花酸提取率（Y） 对编码自变量A，B，C的回归模型方程为：

表2 响应面分析方案及结果

Y=15.76+1.09A+0.89B+0.72C-0.80AB+1.36AC-0.77BC-2.29A2-0.79B20.28C2.

回归方程方差分析见表3。

由表3可知，回归模型具有极高显著性（p＜0.000 1），并且失拟项p=0.972 7＞0.05不显著。该方程的校正决定系数（R2Adj）为0.907 4，R2=0.959 5，表明该模型的拟合度较好，试验误差小。因此，该模型能够反映响应值鞣花酸提取率（Y）的变化，可利用该回归模型方程对超声波辅助提取蓝靛果中鞣花酸的工艺条件进行预测和分析。结合表3中的p值可知，二次项A2对鞣花酸提取率有显著影响（p＜0.05）；C、AC和B2的p值均小于0.01，故它们对鞣花酸提取率有非常显著的影响，其他因素影响不显著。根据F值进一步可知，各个因素对超声波辅助提取蓝靛果中的鞣花酸提取率影响顺序为提取时间（C） ＞提取温度（B） ＞料液比（A）。

表3 回归方程方差分析

2.4.2 响应面优化

各因素交互作用对鞣花酸提取率影响的响应面和等高线见图6。

图6 各因素交互作用对鞣花酸提取率影响的响应面和等高线

由图6可知，变化的响应曲面和疏密程度不同的等高线可以直观地反映超声波辅助提取试验中的料液比（A）、提取温度（B）、提取时间（C） 之间交互作用对蓝靛果中鞣花酸提取率的影响，若等高线呈近似正圆形时，则表示两两因素交互作用不显著；若呈椭圆形或马鞍形时，则表示两两因素交互作用显著[21-22]。

结合以上响应曲面的分析结果，使用Design Expert 8进行最优条件选择，确定最佳蓝靛果中鞣花酸提取工艺参数如下：料液比1∶33.8，提取温度51.1℃，提取时间53.7min，鞣花酸提取率的预测值为18.532 9%。为检查考证试验设计所得结果的可靠性，采取上述工艺参数进3次重复性试验，根据实际操作的情况，对最佳提取工艺参数进行以下调整：料液比1∶33，提取温度51℃，提取时间54 min。在此条件下，3次测得的蓝靛果中鞣花酸提取率均值为18.31%，与预测值差异不显著，说明建立的回归方程能真实准确地反映上述3个因素对鞣花酸提取率的影响，证明该工艺条件可行。

3 结论

超声波辅助法提取蓝靛果中的鞣花酸具有更加节省时间、节约能源、生产成本低等优点。通过单因素考查及Box-Behnken响应面优化试验设计，得到蓝靛果中的鞣花酸最优提取工艺为料液比1∶33（g/mL），提取温度51℃，提取时间54 min，在此条件下对蓝靛果中的鞣花酸进行提取，最终提取率为18.31%。

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Study on Ultrasonic-assisted Extraction of Ellagic Acidfrom Lonicera edulis

WANG Jia'ning1，*MA Yongqiang1，WANG Xin1，LIU Xiaofei1，2，ZHANG Yu1
（1.College of Food Engineering Harbin University of Commerce，Harbin，Heilongjiang 150076，China；2.Food Processing Institute，Helongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin，Heilongjiang 150086，China）

Selected from Heilongjiang Province Boli County of Lonicera edulis as a material.The optimum extraction process was optimized by single factor experiment and response surface method，and the optimum extraction conditions of ellagic acid were determined by ultrasonic assisted method.The results showed that the optimum extraction conditions were as follows：the ratio of material to liquid 1∶33（g∶mL），the extraction temperature 51 ℃ and the extraction time 78 min.The yield of ellagic acid was 18.31%.

lonicera caerulea L.；ellagic acid；ultrasonic-assisted method；response surface methodology

TQ914.1

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.10.040

1671-9646（2017） 10b-0038-05

2017-08-25

黑龙江省应用技术研究与开发设计项目（GC13B204）。

王佳宁（1993— ），女，硕士，研究方向为食品科学。

*通讯作者：马永强（1963— ），男，硕士，教授，博士生导师，研究方向为天然产物。