响应面法优化巴旦木粕蛋白的提取工艺研究

杨晓平，孙 乾，孔令明

响应面法优化巴旦木粕蛋白的提取工艺研究

杨晓平，孙 乾，*孔令明

（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830052）

以巴旦木粕蛋白质提取率作为衡量指标，利用碱溶酸沉法提取巴旦木粕蛋白质。用单因素试验考查料液比、加热温度、加热时间及pH值对巴旦木粕蛋白质提取率的影响，利用数学模型，确定最佳工艺。结果表明，巴旦木蛋白的等电点为4.0；其最佳工艺条件为pH值9.0，料液比1∶22（g∶mL），加热温度48.2℃，加热时间59.2 min。在此工艺条件下，巴旦木蛋白提取率可达58.67%。

巴旦木；蛋白质；提取；响应面法

巴旦木（又称巴达木或巴旦杏）属蔷薇科李亚科桃属，我国种植巴旦杏有1 300多年的历史，其主要产在天山以南，分布于我国新疆南部的偏远沙漠等地。新疆是大陆性气候，早晚温差大、日照长、干旱，植物为适应此环境，在植株体内大量积累糖分和油分。新疆巴旦杏仁较国外的巴旦杏仁含油和糖量均高，味道更为香甜。据相关资料报道，巴旦木杏仁内的脂肪含量达58.02%（其中含有的不饱和脂肪酸占总脂肪酸的85%以上），蛋白质含量在20.81%（其中人体所必需的氨基酸含量为5.43%），水分为6.3%，总糖8.78%，VE含量为8.34 mg/100 g，还含有丰富的矿物质元素和人体所需的多种氨基酸，是一种较为优质的植物蛋白质[1]。研究发现，使用巴旦木提取油脂后，所剩余的巴旦木饼粕中仍含有大量的优质蛋白质，而这些饼粕因不能充分有效利用，常被作为饲料、肥料或被当成残余物废弃，这不仅造成了营养资源的极大浪费，同时也在生产过程中对环境资源造成很大的污染[2]。

由于巴旦木粕的植物蛋白资源相对丰富且较为廉价，并且植物蛋白具有一定的生物活性功能，对其市场的综合开发利用已逐渐成为当今热点。目前，用于提取植物蛋白的方法有很多，如企业批量化生产所常用的碱提酸沉法、酶法、超声波辅助提取法、微波法等。在众多提取方式方法中，碱提酸沉法所需的设备简单、易于操作，适合企业规模化提取植物蛋白。因此，试验使用碱提酸沉法在巴旦木粕中提取蛋白，并对提取工艺进行优化，使用响应面对碱提酸沉工艺进行优化，也为开发新型植物蛋白资源提供了一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

巴旦木，购于新疆乌鲁木齐农贸市场；考马斯亮蓝、95%乙醇、正己烷、NaOH和HCl，以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FW-100型高速万能粉碎机，永康市荣浩工贸公司产品；HH-S型数显恒温水浴锅，北京永光明医疗仪器有限公司产品；PL203型电子天平，梅特勒-托利多仪器，上海有限公司产品；101-1型电热鼓风干燥箱，天津华北试验电炉厂产品；TDL-5-A型低速台式离心机，上海安亭科学仪器厂产品；722N型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司产品；PHS-3C型酸度计，梅特勒-托利多仪器有限公司产品；DRH-100型电热恒温箱，常州博宏高科技设备有限公司产品；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵，巩义市英峪予华仪器厂产品；旋转蒸发仪，上海青浦泸西仪器厂产品；标准分样筛，浙江省上虞市道墟纱筛厂产品；烧杯；容量瓶。

1.3 试验方法

1.3.1 试样的制备

巴旦木经粉碎脱脂后，置于40℃下烘干，用正己烷以3∶1（W/V） 的液料比提取12 h，进行旋转蒸发，收集正己烷重复浸提，如此操作重复3次，收集残渣，置于阴凉干燥处备用[3]。将残渣用粉碎机过40目筛，即为巴旦木粕蛋白。

1.3.2 巴旦木蛋白质的提取工艺

脱脂巴旦木粕→蒸馏水溶解→用NaOH调溶液pH值→离心机离心20 min→取上清液→合并离心所得上清液→用HCl调上清液pH值→再次离心20 min→弃去上清液收集沉淀→以考马斯亮蓝作为标曲→计算提取率。

取一定量的巴旦木粕，以一定料液比制成溶液，用0.6 mol/L的NaOH溶液调pH值，水浴加热一定时间后，可加快可溶性蛋白溶于溶液中，利用离心机以转速4 500 r/min离心20 min，收集上清液[4]。

用1 mol/L盐酸溶液调节所收集的上清液pH值，使上清液中大部分蛋白质沉淀并析出，恒温水浴一定时间后，用离心机以转速4 500 r/min离心20 min，弃上清液收集沉淀，将离心分离的沉淀物水洗至中性，恒温干燥，即为巴旦木粕蛋白质[5]。

1.3.3 考马斯亮蓝法测定蛋白标准曲线

取6支具塞试管按顺序加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL质量浓度为100 μg/mL的标准牛血清蛋白（BSA）溶液，再加入相应量的蒸馏水将溶液定容至1 mL，混合均匀后加入5 mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合后室温下放置5 min，于波长595 nm处测得吸光度，以吸光度（ABS）为纵坐标、标准牛血清蛋白（BSA）质量浓度为横坐标，绘制标准曲线[6]。

1.3.4 样品测定和蛋白质提取率计算

样品测定：蛋白质碱提上清液稀释200倍后，吸取1 mL样品液于刻度试管中，加入考马斯亮蓝试剂5.0 mL，充分混合2 min后，于波长595 nm处测定吸光度。

式中：m——根据标准曲线换算成g的蛋白含量，g；

M——称取的样品含量，g；

v——样品定容体积，mL；

V——测定样液的体积，mL[7]。

1.3.5 单因素试验方法

以巴旦木粕蛋白质的提取率为指标，通过比较料液比 （1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35）、加热温度（30，40，50，60，70℃）、加热时间（30，40，50，60，70 min）、pH 值 （8.0，8.5，9.0，9.5，10.0）对巴旦木粕蛋白质提取率的影响。

1.3.6 响应面法试验设计

在单因素试验的基础上，利用Design Expert 8.0.6软件，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，采用四因素三水平的响应面分析法，选取料液比、加热温度、加热时间、pH值4个因素为自变量，以巴旦木粕蛋白质提取率（Y）为响应值。

响应面试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平设计

2 结果与分析

2.1 考马斯亮蓝法标准曲线绘制

按照1.3.3的方法绘制标准曲线，得到线性回归方程：Y=0.006 6X+0.008 2，相关系数R2=0.999 4，说明Abs在蛋白质量浓度为0～100 μg/mL时线性关系良好。

考马斯亮蓝标准曲线见图1。

图1 考马斯亮蓝标准曲线

2.2 巴旦木粕蛋白提取工艺的确定

2.2.1 加热温度对巴旦木粕蛋白提取率的影响

准确称量脱脂巴旦木蛋白质粕1 g，在加热时间60 min，料液比1∶25（g∶mL），pH值9.0的条件下，按照1.3.2工艺提取蛋白，比较加热温度为30，40，50，60，70℃对巴旦木粕蛋白质提取率的影响，分析试验结果，并得出最佳加热温度[8]。

加热温度对巴旦木粕蛋白质提取率的影响见图2。

图2 加热温度对巴旦木粕蛋白质提取率的影响

由图2可知，在加热时间、料液比、pH值一定的条件下，加热温度从30℃升高至50℃过程中，蛋白提取率迅速升高，在50℃时达到最大值，这可能是由于逐渐升高的温度会对蛋白质的构象产生改变，从而促使巴旦木粕蛋白质的快速溶出。但是，当加热温度继续升高时，蛋白质提取率开始下降，原因可能是温度升高导致蛋白质变性，使蛋白质相互凝结沉淀，提取率下降。因此，选择40，50，60℃3个水平进行响应面分析。

2.2.2 加热时间对巴旦木粕蛋白提取率的影响

准确称量脱脂巴旦木蛋白质粕1 g，在加热温度50℃，料液比1∶25（g∶mL），pH值9.0的条件下，按照1.3.2工艺提取蛋白，比较加热时间为30，40，50，60，70 min对巴旦木粕蛋白提取率的影响，分析试验结果，并得出最佳加热时间[9]。

加热时间对巴旦木粕蛋白质提取率的影响见图3。

图3 加热时间对巴旦木粕蛋白质提取率的影响

由图3可知，在加热温度、料液比、pH值一定的条件下，加热时间越长，巴旦木粕蛋白质提取率越高，但加热时间超过60 min后，提取率呈现出平缓并稍有下降，这可能是部分蛋白分子溶胀饱和，促使提取率趋于平稳。所以，选择50，60，70 min 3个水平进行响应面分析。

2.2.3 料液比对巴旦木蛋白提取率的影响

准确称量脱脂巴旦木蛋白质粕1 g，在加热温度50℃，加热时间60 min，pH值9.0的条件下，按照1.3.2工艺提取蛋白，比较料液比1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35（g∶mL） 对巴旦木粕蛋白提取率的影响，分析试验结果并得出最佳提取料液比[10]。

料液比对巴旦木粕蛋白质提取率的影响见图4。

图4 料液比对巴旦木粕蛋白质提取率的影响

由图4可知，在加热温度、加热时间、pH值一定的条件下，随着料液比的增大，巴旦木粕蛋白质提取率不断升高，这种变化可能由于在料液比较低时，溶液较黏稠，溶液溶解一定量的蛋白质后就会达到饱和状态，因此过低的料液比不利于巴旦木粕蛋白质的充分溶出，料液比为1∶25（g∶mL） 时，提取率达到最大，随着料液比的进一步增大，其提取率增加的幅度几乎不变；但是料液比过大，会增加提取后废水处理的负担，而且会造成提取液中蛋白质浓度偏低，不利于蛋白质的絮凝沉淀，因此选择 1∶20，1∶25，1∶30（g∶mL） 3个水平进行响应面分析。

2.2.4 pH值对巴旦木蛋白提取率的影响

准确称量脱脂巴旦木蛋白质粕1 g，在加热温度50℃，加热时间60 min，料液比1∶25（g∶mL） 的条件下，按照1.3.2工艺提取蛋白，比较pH值为8.0，8.5，9.0，9.5，10.0对巴旦木粕蛋白提取率的影响，分析试验结果，并得出最佳pH值[11]。

pH值对巴旦木粕蛋白质提取率的影响见图5。

图5 pH值对巴旦木粕蛋白质提取率的影响

由图5可知，在加热温度、加热时间、料液比一定的条件下，随着pH值增加，巴旦木粕蛋白质提取率不断升高。在强碱条件下，巴旦木的细胞壁遭到破坏，使蛋白溢出，但是过高的pH值有可能生成有毒的赖氨酰丙氨酸；除此之外，高碱条件下还可能导致蛋白质变性、水解，产生黑褐色物质；不仅会使提取蛋白质的纯度降低，还会增加一定的成本。因此，选择pH值8.5，9.0，9.5这3个水平进行响应面分析。

2.3 巴旦木粕蛋白等电点的测定

碱液浸提后，需要用HCl调节溶液pH值，使得溶液pH值达到巴旦木粕蛋白的等电点，从而使得蛋白质沉淀出来。在利用响应面优化碱液提取工艺试验的基础上，采用单因素试验对所得碱液进行酸沉的试验，使用HCl分别调节碱液的pH值为3.4，3.6，3.8，4.0，4.2，4.4，4.6，4.8，5.0，巴旦木粕蛋白会在其等电点附近逐渐形成絮状，进而沉淀出来，通过静止后离心，采用考马斯亮蓝法测上清液蛋白的含量，吸光度越低，说明上清液中蛋白被沉淀出来。因此，越接近巴旦木粕蛋白的等电点，出现的沉淀则为巴旦木粕分离蛋白质[12]。

巴旦木不同酸沉pH值吸光度大小见图6。

图6 巴旦木不同酸沉pH值吸光度大小

由图6可知，酸沉静置后测得上清液的吸光度呈现出先下降后上升，这主要是由于上清液中的巴旦木粕蛋白在等电点附近因电荷量为零而产生絮状凝聚沉降，在pH值4.0附近，吸光度显现出最低值，因此确定巴旦木粕蛋白的酸沉点为pH值4.0。

2.4 响应面模型的建立与结果分析

试验设计及结果见表2。

通过Design Erpert 8.0软件对试验数据进行分析，得到回归方程为：

在回归方程中，对所得回归方程做显著性检验与方差分析。

回归模型方差分析见表3。

运用Design Erpert 8.0软件可以得到巴旦木粕蛋白提取率（Y）对自变量料液比（X1）、加热温度（X2）、加热时间（X3）、pH值（X4）的二次多项回归模型。

由表3可知，该模型的显著性检验p＜0.000 1，说明模型极显著；相关系数R2=0.986，说明该模型可行性好。失拟项不显著（p=0.062 8），说明回归模型和实际试验拟合充分，模型可行性和精确度高，可以用该模型对超声波辅助提取巴旦木蛋白的工艺进行分析预测[13]。

表2 试验设计及结果

表3 回归模型方差分析

2.5 巴旦木粕蛋白提取的响应面分析

各因素对巴旦木粕蛋白提取率的影响顺序为料液比＞pH值＞加热温度＞加热时间，其中料液比和pH值对巴旦木粕蛋白的提取率影响较大[14]。

各因素的交互作用以及对响应值的影响可通过响应面及等高线的形状反映，响应面坡度越陡、等高线密集成椭圆形表示交互作用的两因素影响越大，而圆形表示不显著。等高线的圆心处为极值条件。图7～图10为交互作用显著的因素对巴旦木蛋白质提取率的影响[15-16]。

交互作用响应面见图7，交互作用等高线见图8，交互作用响应面见图9，交互作用等高线见图10。

图7 交互作用响应面

图8 交互作用等高线

图9 交互作用响应面

3 结论

（1）通过单因素试验得出巴旦木粕蛋白提取的最适条件为pH值9.0，料液比1∶25（g∶mL），加热温度50℃，加热时间60 min。

图10 交互作用等高线

（2）运用响应面优化结果并进行回归分析，确定了巴旦木粕蛋白质提取率的试验模型为：

经软件分析结果可知，巴旦木粕蛋白质的提取的最佳条件为pH值9.0，料液比1∶22（g∶mL），加热温度48.2℃，加热时间59.2 min。在此条件下脱脂巴旦木粕蛋白质得率为58.67%。为了便于实践操作，将其条件稍微改动为pH值9.0，料液比1∶25（g∶mL），加热温度50℃，加热时间60 min，同时进行3次重复试验，得到实际脱脂巴旦木粕蛋白质得率为57.88%，与响应面法预测值较为接近。

新疆特殊的地域条件不仅为栽培巴旦木提供了良好的生态环境，同时也在研发和开发巴旦木等系列产品并逐步推广到市场。如巴旦木豆腐、巴旦木植物蛋白发酵饮料等新型产品都对蛋白含量有一定的要求，而巴旦木粕蛋白是一种营养价值很高、综合利用性强的优良植物蛋白，为日后人们摄取优质植物蛋白提供了一定的研究基础。

我国新疆地区巴旦木种植面积较广，对巴旦木榨油后的饼粕进行蛋白提取，不仅实现了废物利用，而且还有较高营养价值的优质蛋白，可用于保健食品的开发，为其拓宽了利用蛋白质的应用范围。

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Study on Optimization of Extraction Technology of Sweet Almond Protein by Response Surface Method

YANG Xiaoping，SUN Qian，*KONG Lingming
（College of Food and Pharmaceutics，Xinjiang Agricultural University，Urumqi，Xinjiang 830052，China）

Sweet almond meal to protein extraction rate as the index，the use of alkali solution and acid extraction of sweet almond protein precipitation method.By single factor experiment study ratio of material heating temperature，heating time and pH value，liquid on sweet almond meal protein extraction rate，establishment of mathematical model，to determine the best process.Test results showed that the isoelectric point of sweet almond protein 4.0.The optimal process condition for：pH value 9.0，solid to liquid ratio 1∶22 （g∶mL） and heating temperature 48.2 ℃，heating time 59.2 min.Under the optimum conditions，the extraction rate of sweet almond protein could reach 58.67%.

sweet almond；protein；extraction；response surface analysis

S662.9

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.10.038

1671-9646（2017） 10b-0029-05

2017-06-01

热榨植物油饼粕中变性蛋白改性修饰关键技术研究（201411107）

杨晓平（1976— ），男，硕士，副教授，研究方向为农产品加工与综合利用。*

孔令明（1976— ），男，博士，教授，研究方向为农产品加工与综合利用。